發(fā)布時間：2018-06-28 11:34

  本文選題：PGAM1 + 腎透明細胞癌��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,重威脅著人們的生命健康。據(jù)統(tǒng)計在我國腎癌的發(fā)病率呈年輕化趨勢,且每10萬人群中約有37位男性及16位女性患者被確診為腎癌。由于腎癌患者早期無明顯癥狀,25%-30%患者入院診斷時已為中晚期；同時,腎癌患者對放療及化療并不敏感,因此,腎癌患者的主要治療方式為手術(shù)切除,然而20%以上的患者術(shù)后可能復(fù)發(fā)。因此,目前對于腎癌的治療仍不理想。透明細胞癌是腎癌最常見的組織學(xué)類型,約占70%-90%。然而,由于腎透明細胞癌發(fā)生及發(fā)展的機制尚不明確,對腎透明細胞癌治療新藥物的研發(fā)也帶來了極大的困難。因此,深入開展腎透明細胞發(fā)生及發(fā)展方面的基礎(chǔ)研究具有重要的意義。近年來,隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,與腎透明細胞癌發(fā)生及發(fā)展有關(guān)的越來越多蛋白被發(fā)現(xiàn),蛋白標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)不僅有助于腎癌患者的預(yù)后評估,同時也有助于臨床上對腎癌的診斷、術(shù)后局部復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移的預(yù)測、也有望成為分子靶向藥物研發(fā)的的靶點,應(yīng)用于臨床治療。因此,尋找與腎透明細胞癌相關(guān)的新基因,將有助于闡述腎透明細胞癌發(fā)生的機制,為其診斷及治療提供有價值的參考依據(jù)。PGAM1為PGAM家族成員,最初在腦組織內(nèi)發(fā)現(xiàn),才被命名為PGAM1;另一個成員與PGAM1為同型二聚體,主要存在于成熟骨骼肌和心肌組織中,命名為PGAM2[14-15]。PGAM1定位于人染色體10q25.3區(qū)域,全長1709 bp,包括31bp的非翻譯區(qū)(5'UTR),765-bp的編碼區(qū),913bp的非翻譯區(qū)(3'UTR)。其cDNA編碼一個長約254個氨基酸,分子量為28784 Da的蛋白質(zhì),其活性位點內(nèi)的三個氨基酸,分別為Hisll, Arg62和His186。而PGAM2的cDNA編碼253個氨基酸和一個較短的非翻譯區(qū)。PGAM1與PGAM2具有80%同源性,但二者含有不同酸性和堿性氨基酸殘基。PGAM2在人類基因組只有一個拷貝數(shù),而PGAM1基因有多個拷貝數(shù)。因此,PGAM1基因被認為是PGAM2的祖基因。目前的研究認為PGAM1參與調(diào)控糖代謝活動,主要將3-磷酸甘油酸催化生成2-磷酸甘油酸,最終降解為磷酸烯醇式丙酮酸；其表達與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展也密切相關(guān),在結(jié)直腸癌、肝癌肺癌及乳腺癌組織中均發(fā)現(xiàn)了其表達高于周邊正常組織,然而在腦部腫瘤中卻發(fā)現(xiàn)其表達低于周邊正常組織。盡管如此,目前研究并沒有檢測PGAM1在腎透明細胞癌中的表達目的1、探討PGAM1在腎透明細胞癌及癌旁相對正常腎組織中的表達及其臨床意義。2、探討PGAM1在在腎透明細胞癌組織中的表達與患者預(yù)后的關(guān)系。3、探討PGAM1表達下調(diào)對腎透明細胞癌細胞生物學(xué)功能的影響及其作用機制。方法1、收集192例腎透明細胞癌組織及80例腎癌遠端正常腎組織中,經(jīng)固定、脫水制成石蠟組織塊,采用免疫組化檢測PGAM1的表達,并分析PGAM1在腎透明細胞癌組織中的表達與臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后的關(guān)系。2、采用qRT-PCR定量檢測了3對腎透明細胞癌及配對遠端正�！I組織中PGAM1mRNA的表達,同時,通過Western blot定量檢測了8對腎透明細胞癌及配對正常腎組織中PGAM1蛋白的表達情況,進一步明確PGAM1在’腎癌及癌旁腎組織中的表達。3、采用qRT-PCR檢測了PGAM1在腎透明細胞癌細胞株RLC-310及Caki-2中的表達。同時,行siRNA干擾片段瞬時轉(zhuǎn)染,敲低PGAM1在’腎透明細胞癌細胞株RLC-310及Caki-2中的表達,并行qRT-PCR及Western blot進行驗證。4、采用流式細胞儀檢測PGAM1表達下調(diào)對腎透明細胞癌細胞株RLC-310及Caki-2中凋亡的影響；同時,采用MTT實驗檢測PGAM1表達下調(diào)對腎透明細胞癌細胞株RLC-310及Caki-2增殖的影響。5、通過qRT-PCR及Western blot檢測腎透明細胞癌細胞株RLC-310及Caki-2中PGAM1表達下調(diào)后,P53、Caspase 3及Caspase 9的表達情況,初步探討PGAM1發(fā)揮生物學(xué)功能的機制。結(jié)果1. PGAM1在腎透明細胞癌中的表達首先,我們通過免疫組化檢測了192例腎透明細胞癌組織及80例腎癌遠端正常’腎組織中PGAM1的表達,結(jié)果表明PGAM1陽性表達主要定位于細胞質(zhì),在正常腎組織及腎透明細胞癌組織中均可見陽性表達。其中,正常腎組織中,陰性表達20例(25.0%),弱陽性表達34例(42.5%),中度陽性表達20例(25.0%),強陽性表達6例(7.5%)；腎透明細胞癌組織中,陰性表達59例(30.7%),弱陽性表達45例(23.4%),中度陽性表達71例(37.0%),強陽性表達17例(8.9%)；統(tǒng)計學(xué)分析表明,兩組差異明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義(表1-1,P=0.017)。隨后,我們進行了半定量分析,發(fā)現(xiàn)PGAM1在腎透明細胞癌中104例(54.2%)呈低表達,88例(45.8%)呈高表達；在正常腎組織中,54例(67.5%)呈低表達,26例(32.5%)呈高表達,統(tǒng)計學(xué)分析也顯示兩組差異明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義(表1-2,P=0.044)。隨后,我們采用qRT-PCR定量檢測了三對腎透明細胞癌及配對遠端正常腎組織中PGAM1mRNA的表達,結(jié)果表明PGAM1在腎透明細胞癌中的表達約為正常腎組織中表達的4.2倍,明顯高于正常腎組織,統(tǒng)計學(xué)分析表明差異明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1-2,P=0.004)。 同時,我們通過Western blot也定量檢測了8對腎透明細胞癌及配對正常腎組織中PGAM1蛋白的表達情況,結(jié)果表明PGAM1蛋白在腎透明細胞癌中的表達為正常腎組織中的3.2倍,明顯高于正常腎組織,統(tǒng)計學(xué)分析表明差異明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1-2,P=0.001)同時,我們也探討PGMA1在腎透明細胞癌表達與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示：PGMA1表達與年齡、腫瘤大小及T分期相關(guān),而與性別、腫瘤位置及吸煙史無明顯相關(guān)。其中,92例年齡57歲患者中12例患者PGMA1呈高表達,其高表達率明顯低于57歲患者(43/100),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005)。58例腫瘤直徑≥5 cm患者中,34例患者呈高表達,其高表達率明顯高于腫瘤直徑5 cm的腫瘤患者(54/134),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0027)。80例T2-T3患者中,46例呈PGAM1高表達,其高表達率明顯高于T1期患者,差異明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.008)。2.腎透明細胞癌中PGAM1表達與患者預(yù)后的關(guān)系依據(jù)腎細胞癌患者的預(yù)后相關(guān)資料,我們采用Kaplan-Meier法探討了臨床病理特征與腎透明細胞癌患者預(yù)后的關(guān)系,結(jié)果表明腎透明細胞癌患者的預(yù)后與PGAM1表達、腫瘤大小及T分期密切相關(guān)。其中,PGAM1高表達患者的平均生存時間為48月,明顯低于PGAM1低表達患者的平均生存時間(56月),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。同時,結(jié)果顯示腫瘤直徑5 cm患者的術(shù)后平均生存時間為55月,明顯高于腫瘤直徑≥5 cm的患者(47月),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。T1患者的平均生存時間為55月,明顯高于T2-T3期患者(49月),差異明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。然而,年齡、性別、腫瘤位置及吸煙史與患者的預(yù)后無明顯相關(guān)(P0.05)。隨后,我們探討了PGAM1表達與臨床病理特征的關(guān)系對患者預(yù)后的影響。我們發(fā)現(xiàn)在年齡57歲的患者中,PGAM1高表達患者預(yù)后明顯差于低表達患者(P=0.000)；而在年齡57歲的患者中,PGAM1表達與預(yù)后無明顯相關(guān)(P=0.203)。在男性患者中,PGAM1高表達患者預(yù)后明顯差于低表達患者(P=-0.000)；同樣,在女性患者中,PGAM1高表達患者預(yù)后明顯較差(P=0.013)。在左側(cè)腎透明細胞癌中,PGAM1高表達患者預(yù)后明顯差于低表達患者(P=0.000)；而在右側(cè)腎透明細胞癌中,PGAM1表達與預(yù)后無明顯相關(guān)(P=0.579)；在有吸煙史及無吸煙史患者中,PGAM1高表達患者預(yù)后均明顯差于低表達患者(P=0.000,P=0.006)。在腫瘤小于5cm的腎透明細胞癌患者中,PGAM1高表達患者預(yù)后明顯差于低表達患者(P=0.000)；而在腫瘤5cm腎透明細胞癌中,PGAM1表達與預(yù)后無明顯相關(guān)(P=0.47)；在T1期腎透明細胞癌患者中,PGAM1高表達患者預(yù)后明顯差于低表達患者(P=0.000)；而在T2-T3期腎透明細胞癌患者中,PGAM1表達與預(yù)后無明顯相關(guān)(P=0.945)。多因素回歸分析PGAM1及腫瘤大小可作為腎透明細胞癌患者預(yù)后評估的獨立因素,而T分期并不能作為腎透明細胞癌患者預(yù)后評估的獨立因素。3.敲低PGAM1表達對腎透明細胞癌細胞生物學(xué)功能的影響我們首先通過qRT-PCR檢測了PGAM1在腎透明細胞癌細胞株RLC-310及Caki-2中的表達,發(fā)現(xiàn)在腎透明細胞癌細胞株RLC-310及Caki-2中均能檢測到PGAM1的表達,其中RLC-310中的表達高于Caki-2。隨后,我們通過siRNA干擾技術(shù)將PGAM1干擾片段瞬時轉(zhuǎn)染了兩株細胞,并采用qRT-PCR及Western blot進行了相應(yīng)的驗證。qRT-PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示經(jīng)轉(zhuǎn)染后,PGAM1在RLC-310及Caki-2細胞中的表達均明顯下調(diào),差異明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001,P=0.008),表明RLC-310及Caki-2中PGAM1表達被成功敲低,PGAM1干擾片段成功轉(zhuǎn)染。隨后,通過MTT實驗探討了PGM1表達下調(diào)對透明細胞癌細胞增殖能力的影響。結(jié)果表明在RLC-310細胞中,PGAM1表達下調(diào)后細胞增殖時檢測到的OD值與對照組相比明顯降低(P=0.000),生長曲線較平緩。同樣,在Caki-2細胞中,PGAM1表達下調(diào)后細胞增殖時檢測到的OD值與對照組相比明顯降低(P=0.000),生長曲線較平緩,表明PGAM1表達下調(diào)后Caki-2細胞增殖能力減弱。同時,采用流式細胞儀檢測了PGAM1表達下調(diào)對腎透明細胞癌細胞凋亡的影響。結(jié)果表明：在RLC-310細胞中,PGAM1表達下調(diào)后細胞的凋亡率為15.67%±0.52%,而對照組細胞的凋亡率為5.21%±1.04%,兩組經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,差異明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。在Caki-2細胞中,PGAM1表達下調(diào)后細胞的凋亡率為11.83%±1.09%,而對照組細胞的凋亡率為4.81%±1.33%,兩組經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,差異明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)。4. PGAM1表達下調(diào)發(fā)揮生物學(xué)功能相關(guān)機制的初步研究首先,我們通過qRT-PCR檢測了P53、Caspase 3及Caspase 9的在RLC-310腎透明癌細胞株中的表達,結(jié)果顯示PGAM1表達下調(diào)后P53、Caspase 3及Caspase 9表達均明顯上調(diào),與對照組相比,差異明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。隨后,我們也檢測了P53、Caspase 3及Caspase 9的在Caki-2腎透明癌細胞株中的表達,結(jié)果也顯示PGAM1表達下調(diào)后P53、Caspase 3及Caspase 9表達也均明顯上調(diào),與對照組相比,差異明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。隨后,為了進一步證實PGAM1表達下調(diào)對P53、Caspase 3及Caspase 9的影響,我們通過Western blot進行了相應(yīng)驗證。在RLC-310腎透明癌細胞株中的,結(jié)果顯示：與對照組相比,PGAM1表達下調(diào)后P53、Caspase 3及Caspase 9表達均上調(diào)。經(jīng)灰度值檢測分析,表明PGAM1表達下調(diào)后P53、Caspase 3及Caspase9的OD值明顯下降,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),提示GAM1在RLC-31表達下調(diào)后上調(diào)了P53、Caspase 3及Caspase 9表達。同樣,在Caki-2腎透明癌細胞株中的,結(jié)果顯示：與對照組相比,PGAM1表達下調(diào)后P53、Caspase 3及Caspase9表達均上調(diào)。經(jīng)灰度值檢測分析,表明PGAM1表達下調(diào)后P53、Caspase 3及Caspase 9的OD值明顯下降,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),提示GAM1在Caki-2表達下調(diào)后上調(diào)了P53、Caspase 3及Caspase 9表達。結(jié)論：1.PGAM1在腎透明細胞癌組織中的表達明顯高于周圍正常腎組織,其在腎透明細胞癌組織中的表達與腎透明細胞癌的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)。2. PGAM1表達與腎透明細胞癌患者的臨床病理特征相關(guān),并影響患者的預(yù)后相關(guān),PGAM1可作為腎透明細胞癌預(yù)后評估的獨立因素。3. PGAM1表達下調(diào)具有促進腎透明細胞癌細胞凋亡,抑制其增殖的生物學(xué)功能,其作用機制與P53/Caspase 3/Caspase 9信號通路相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.11

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本文編號：2077861