發(fā)布時間：2018-06-24 18:32

  本文選題：MLL2 + A549肺癌細胞��； 參考：《南昌大學》2016年博士論文

【摘要】：目的:肺癌對人類健康和生活造成巨大危害,并且肺癌五年生存率不到15%,是人類因癌癥死亡的主要原因。許多致癌物質(zhì)都可以通過癌基因和抑癌基因的激活或抑制促使活細胞轉(zhuǎn)化為癌癥細胞。MLL2存在于各種上皮細胞和組織的癌細胞中,如前列腺癌,結(jié)腸癌,肺癌和肝癌中被發(fā)現(xiàn)。因為這些腫瘤細胞中MLL2基因啟動子的Cp G島的甲基化顯著增加,因此它被認為是一種腫瘤基因。本研究主要針對MLL2對肺癌細胞的影響進行研究,討論了MLL2基因誘導人肺腺癌A549細胞增殖,遷移和侵襲的可能機制,研究了肺癌MLL2基因?qū)M蛋白H3和H4賴氨酸殘基甲基化的影響,最后通過生物信息學方法分析了可能的相關(guān)基因與信號轉(zhuǎn)導通路。方法:1、從構(gòu)建過表達和基因沉默MLL2的A549肺癌細胞出發(fā),研究這兩種A549肺癌細胞的生物學行為的影響。2、通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染含有MLL2基因的質(zhì)粒,RT-PCR法,Western Blot,CCK-8細胞測定蛋白表達、以及A549肺癌細胞增殖和集落形成。3、采用熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測MLL2,MMP-2(基質(zhì)金屬蛋白酶-2),PKR(雙鏈RNA依賴性蛋白激酶)的m RNA表達,Western Blot檢測PKR、MLL2和MMP-2的表達;用Transwell小室進行遷移和侵襲實驗檢測A549細胞增殖。4、過表達和沉默MLL2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人肺腺癌A549細胞,采用Western Blot和免疫熒光試驗檢測MLL2對H3K4me3,H3k4me2,H3k4me1,H3K9me3,H3k9me2,H3k9me1,H3k27me3,H3k27me2,H3k27me1,H3k36me3,H3k36me2,H3k36me1,H4k20me3的甲基化狀態(tài)的作用。5、采用R/Bioconductor分析和挖掘基因芯片的數(shù)據(jù)。下載GEO中包含經(jīng)過蘿卜籽素處理前后的A549肺癌細胞的原始數(shù)據(jù),然后進行標準化處理、質(zhì)控、差異基因的篩選與分析、GO分析、聚類以及通路總結(jié),進一步的分析基因調(diào)控網(wǎng)絡以及分子相互作用。結(jié)果:我們成功構(gòu)建了過表達MLL2的A549肺癌細胞,通過MTT法檢測,發(fā)現(xiàn)該細胞過度表達MLL2基因,與空載體組和對照組相比,過表達MLL2的細胞侵襲遷移顯著增加,同類細胞之間粘附降低,異質(zhì)細胞粘附則增強了,而且擴散加速和集落形成率均發(fā)生了提高。此外,MLL2促使MMP-2 m RNA表達顯著增加;P-PKR蛋白的表達則降低;PKR m RNA的表達與對照組和空載體組相比無顯著差異。Western Blot分析表明,MLL2造成H3K9me3的表達削弱,而沉默MLL2增強H3K9me3的表達,H3組蛋白20位點和H4組蛋白4、27、36位點的甲基化狀態(tài)則沒有顯著差異。免疫熒光表明MLL2造成H3K9me3表達增強,并且與Western Blot結(jié)果一致。最后,通過生物信息學的結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)了經(jīng)過蘿卜籽素處理前后A549肺癌細胞與MLL2相關(guān)的癌基因發(fā)生了下調(diào)。結(jié)論:我們發(fā)現(xiàn)過度表達MLL2可以促進A549肺癌細胞生長,促進MMP-2和PKR磷酸化,促進肺腺癌A549細胞增殖,遷移和侵襲。并且,肺癌基因MLL2有去H3K9me3甲基化的功能,而且沒有對其它賴氨酸產(chǎn)生甲基化。最后,通過生物信息學的結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)蘿卜籽素的處理可以抑制A549肺癌細胞MLL2相關(guān)的癌基因,有助于抑制肺癌細胞的發(fā)展。
[Abstract]:Objective: lung cancer does great harm to human health and life, and the 5-year survival rate of lung cancer is less than 15%, which is the main cause of human cancer death. Many carcinogens can be activated or suppressed by oncogenes and suppressor genes to induce the transformation of living cells into cancer cells. MLL2 is found in cancer cells of various epithelial cells and tissues such as prostate cancer colon cancer lung cancer and liver cancer. Because the methylation of the CP G island of the MLL2 gene promoter is significantly increased in these tumor cells, it is considered to be a tumor gene. In this study, the effect of MLL2 on lung cancer cell line was studied. The possible mechanism of MLL2 gene induced proliferation, migration and invasion of human lung adenocarcinoma A549 cell line was discussed, and the effect of MLL2 gene on histone H3 and H4 lysine residue methylation was studied. Finally, the related genes and signal transduction pathways were analyzed by bioinformatics. Methods: to investigate the biological behavior of A549 lung cancer cells by constructing overexpression and gene silencing MLL2 cells, the biological behavior of these two A549 lung cancer cells was studied. The expression of protein was detected by Western BlotCK-8 cells transfected with the plasmid containing MLL2 gene by RT-PCR. And the proliferation and colony formation of A549 lung cancer cells. The mRNA expression of MLL2mpMMP-2 (matrix metalloproteinase-2) and PKR (double-stranded RNA-dependent protein kinase) was detected by fluorescence quantitative PCR (FQ-PCR). Western blot was used to detect the expression of PKRMLL2 and MMP-2. The proliferation of A549 cells was detected by transwell chamber migration and invasion assay. Overexpression and silencing of MLL2 plasmid were transfected into human lung adenocarcinoma A549 cells. The effect of MLL2 on the methylation state of H3K4me3me3me2H3k4me1h3k9me1H3k9me1H3k27me3me2H3k27me2H3k27me2H3k36me2H3k36me2H3k36me2H3k36me2H4k20me3 was detected by Western Blot and immunofluorescence assay, and the data of H3k36me2H3k36me1H4k20me3 was analyzed and mined by RBioconductor. The GEO contains raw data of A549 lung cancer cells before and after treatment with radish seed hormone, then standardized treatment, quality control, screening and analysis of differential genes, clustering and pathway summarization. Further analysis of gene regulatory networks and molecular interactions. Results: A549 lung cancer cells expressing MLL2 were successfully constructed. The overexpression of MLL2 gene was detected by MTT assay. Compared with empty vector group and control group, overexpression of MLL2 increased significantly in invasion and migration of A549 lung cancer cells. The adhesion between the same cells decreased, the adhesion of heterogeneous cells increased, and the diffusion rate and colony formation rate increased. In addition, MLL2 increased the expression of MMP-2 mRNA significantly, but decreased the expression of pPKR mRNA. Western blot analysis showed that MLL2 induced the decrease of H3K9me3 expression. There was no significant difference in methylation between H3K9me3 histone 20 and H4 histone 42736 by silencing MLL2. Immunofluorescence showed that MLL 2 increased the expression of H 3K 9me3, which was consistent with the results of Western Blot. Finally, we found that the MLL2-related oncogene was down-regulated in A549 lung cancer cells before and after treatment with radish seed. Conclusion: overexpression of MLL2 can promote the growth of A549 lung cancer cells, promote the phosphorylation of MMP-2 and PKR, and promote the proliferation, migration and invasion of A549 cells. Moreover, the lung cancer gene MLL2 has the function of demethylation of H _ 3K _ 9me _ 3 and does not produce methylation of other lysine. Finally, through the bioinformatics results, we found that the treatment of radish seed can inhibit the MLL2-related oncogene in A549 lung cancer cell line, which is helpful to inhibit the development of lung cancer cells.
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：2062519