本文選題：miR-146a + 巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子�。� 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景神經(jīng)膠質(zhì)瘤是21世紀(jì)危害人健康的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率居顱內(nèi)腫瘤首位,具有遺傳不穩(wěn)定性,組織病理學(xué)表現(xiàn)多變以及不可預(yù)測(cè)的臨床行為等特點(diǎn)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織基于病理結(jié)果及形態(tài)學(xué)分類描述將其分為四級(jí),級(jí)別越高表明其惡性程度越高,高級(jí)別膠質(zhì)瘤如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等因其易向周圍腦組織浸潤(rùn)生長(zhǎng),故單純手術(shù)切除一般難以完全治愈,常術(shù)后輔以化療、放療,基因治療,免疫治療等,但預(yù)后常較差,中位生存期較短。近年來,有關(guān)膠質(zhì)瘤的早期診斷,以及發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,分子生物學(xué)治療的靶點(diǎn)研究成為研究的主要目標(biāo)。大量研究證實(shí),一種新型的非編碼小RNA分子—微小RNA (miRNA)在多種腫瘤中異常表達(dá)且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及血管形成和侵襲生長(zhǎng)密切相關(guān),其中包括膠質(zhì)瘤。miRNA是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA(約17-20個(gè)核苷酸),它在進(jìn)化過程中高度保守。通過和目標(biāo)mRNA的3'-UTR靶向結(jié)合調(diào)控轉(zhuǎn)錄后蛋白表達(dá)和mRNA降解。初級(jí)miRNA (pri-miRNA)在RNA聚合酶Ⅱ作用下轉(zhuǎn)錄而來,后經(jīng)核酸酶Drosha切割成長(zhǎng)約70個(gè)核苷酸的前體。在此之后前體miRNA通過exportin-5運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中,由Dicer復(fù)合物轉(zhuǎn)化為成熟miRNA。然后很快被引導(dǎo)進(jìn)入RNA沉默復(fù)合體(RISC)復(fù)合體中,然后可和mRNA互補(bǔ)配對(duì),調(diào)控mRNA的翻譯和穩(wěn)定性。其對(duì)于目標(biāo)mRNA的表達(dá)的調(diào)控,無論是被降解還是蛋白翻譯抑制,這都完全取決于“種子”序列的互補(bǔ)性。在機(jī)體許多生理和病理過程中發(fā)揮重要作用,包括胚胎發(fā)育、組織生長(zhǎng)、腫瘤發(fā)生、心律失常、缺血性心臟病、心肌肥厚、病毒性肝炎和糖尿病等。目前許多報(bào)道研究表明多種腫瘤的發(fā)生,血管生成,侵襲以及細(xì)胞凋亡等過程均和miRNA關(guān)系密切。據(jù)預(yù)測(cè)人類基因組中約有700多種miRNA,但是大多數(shù)的生物學(xué)功能仍未知。近年來關(guān)于miR-146a的研究日益引起研究者的興趣。miR-146a位于5號(hào)染色體LOC285628基因,其成熟序列在第2外顯子,其主要在先天免疫應(yīng)答過程中起負(fù)調(diào)控作用,研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)微生物組分脂多糖(LPS)和細(xì)胞因子IL-1b、TNF-α刺激THP-1細(xì)胞時(shí),成熟miR-146a的表達(dá)量即增加。另有報(bào)道示人類T細(xì)胞白血病病毒Ⅰ型(HTLV-I,和T淋巴細(xì)胞性白血病發(fā)生有關(guān))、EB病毒感染和miR-146a的表達(dá)也具有相關(guān)性。其在許多炎癥性疾病和腫瘤的發(fā)病機(jī)制中的作用成為目前研究的熱點(diǎn),這可能和其可抑制靶點(diǎn)的表達(dá)有關(guān),近期研究發(fā)現(xiàn)在自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和銀屑病中miR-146a的表達(dá)量也發(fā)生變化。最初關(guān)于miR-146a在腫瘤發(fā)生中的作用是由He等研究發(fā)現(xiàn)在甲狀腺乳頭狀癌患者的正常甲狀腺部分,其表達(dá)量明顯增高。隨后,關(guān)于兒童急性淋巴細(xì)胞白血病和急性髓系白血病,淋巴瘤,鼻咽癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展和miRNA的表達(dá)異常的關(guān)系的報(bào)道日益增多。另外,關(guān)于其在主要骨骼肌性疾病中的異常表達(dá)也相繼報(bào)道�？傊�,miR-146a在這些疾病發(fā)生發(fā)展中的作用和其靶基因IRAK1、IRAK2、TRAF6、RIG-I、IRF-5、STAT-1、PTC1等在翻譯后抑制有關(guān)。研究已經(jīng)證實(shí),膠質(zhì)瘤患者中miR-146a表達(dá)量低于正常神經(jīng)膠質(zhì)組織,并且在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)量也低于正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,而且miR-146a的低表達(dá)患者往往WHO分級(jí)較高。研究表明miR-146a和膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但其具體作用機(jī)制尚不清楚。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor, MIF),是一種多效的炎癥介質(zhì),目前被發(fā)現(xiàn)的最早的細(xì)胞因子之一。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)最初是從T淋巴細(xì)胞的上清液中分離提取出來,故被描述為可溶性的具有抑制巨噬細(xì)胞遷移性能的生物因子。其分子量約為12.5kDa,由115個(gè)氨基酸構(gòu)成的兩個(gè)反平行α-螺旋和六個(gè)β-折疊,在內(nèi)皮細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)。其活性形式為三個(gè)相同亞基構(gòu)成的同源三聚體,其羧基末端決定酶活性。MIF作為中間介質(zhì)在多種疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,包括動(dòng)脈粥樣硬化、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS).類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。作為一種促炎癥分子,MIF在TNF-α、IL-1、 PGE2和單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等活化等過程中起重要作用。miR-146a和MIF兩者在膠質(zhì)瘤中異常表達(dá),我們推測(cè)MIF可能是miR-146a一個(gè)下游靶蛋白。因此,在上述基礎(chǔ)上,本文旨在探討miR-146a靶向調(diào)節(jié)MIF表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。本文將分三部分進(jìn)行論述,分別用RT-PCR和免疫組織化學(xué)方法從基因水平和蛋白水平法檢測(cè)miR-146a和IHC和MIF在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織和不同細(xì)胞系中的表達(dá)情況,熒光素酶報(bào)告基因分析驗(yàn)證MIF是否為miR-146a的下游靶向蛋白,并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-146a模擬序列轉(zhuǎn)入膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,檢測(cè)MIF的表達(dá)量的變化,MTT法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測(cè)定。第一部分miR-146a和MIF在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及臨床意義目的探討miR-146a和MIF在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及不同病理級(jí)別的相關(guān)性分析和臨床意義方法本研究收集2014年6月至2015年7月在山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院經(jīng)手術(shù)治療和術(shù)后病理證實(shí)的膠質(zhì)瘤組織和相應(yīng)非腫瘤正常腦組織標(biāo)本各20例。根據(jù)2007年WHO顱內(nèi)腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期。分期如下：Ⅰ-Ⅱ期14例,Ⅲ-Ⅳ期6例。其中男性患者9例,女性患者11例,年齡31-56歲,每份標(biāo)本分成兩份,一份行RT-PCR檢測(cè),另一份行免疫組織化學(xué)檢測(cè)MIF表達(dá)。結(jié)果1、RT-PCR結(jié)果顯示miR-146a在癌旁正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中均表達(dá),且在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織,比值為(0.68±0.05)vs(0.23±0.00),差異顯著(p0.05),且隨著腫瘤WHO級(jí)別的增高,其表達(dá)量降低；2、RT-PCR結(jié)果顯示MIF mRNA在癌旁正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中均表達(dá),且在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常腦組織；3、免疫組化結(jié)果顯示,MIF在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織(0.89±0.02)vs.(5.49±0.48),(p0.01),且隨著腫瘤惡性程度增加,其表達(dá)量亦增加;4、RT-PCR結(jié)果示當(dāng)miR-146a的表達(dá)量增加時(shí),MIF mRNA的表達(dá)量隨之降低,反之,當(dāng)miR-146a的表達(dá)量較低時(shí),MIF mRNA的表達(dá)量增高。結(jié)論1、miR-146a和MIF在癌旁正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中均表達(dá),但在膠質(zhì)瘤組織中miR-146a表達(dá)下調(diào),MIF表達(dá)上調(diào)；2、MIF主要分布于細(xì)胞質(zhì)中,且在癌旁正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中均表達(dá)；3、miR-146a和MIF在膠質(zhì)瘤中表達(dá)和膠質(zhì)瘤惡性程度相關(guān)。第二部分miR-146a過表達(dá)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲增殖的影響目的探討過表達(dá)miR-146a對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響方法體外培養(yǎng)U251,U87,C6三種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系以及正常星形膠質(zhì)細(xì)胞(RA),分別對(duì)其進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)miR-146a的表達(dá)情況。根據(jù)三種細(xì)胞系miR-146a的表達(dá),選擇U87細(xì)胞系繼續(xù)進(jìn)行研究,將其分成兩組,分別為轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物組(miR-146a mimic組),miR-146a陰性對(duì)照組(negative control, NC組)。MTT法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-146a對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87增殖活力作用的影響。結(jié)果1、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明,在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251,U87和C6中miR-146a的表達(dá)均明顯低于正常星形膠質(zhì)細(xì)胞(RA),(0.20 ± 0.02,0.24 ± 0.04, 0.51 ± 0.05,0.52 ± 0.02) vs(0.75 ± 0.02),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)；2、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果示,U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物后,miR-146a mimic組細(xì)胞活力與NC組相比明顯降低(P=0.0074)；3、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果示miR-146a mimic組細(xì)胞相比NC組集落形成能力明顯下降(68.34士8.23)vs(35.49士3.65),(P=0.00032)。結(jié)論1、miR-146a在正常星形膠質(zhì)細(xì)胞和三種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中均表達(dá),但在三種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào),且在U87細(xì)胞系中表達(dá)適中；2、miR-146a上調(diào)可降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性；第三部分miR-146a靶向調(diào)控MIF對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用機(jī)制目的探討miR-146a靶向調(diào)控MIF對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用機(jī)制方法miR-146a模擬物(miR-146a mimic), MiR-146a陰性對(duì)照(NC),野生型載體pGL3-MIF 3'UTR-Wt和突變型載體pGL3-MIF 3'UTR-Mut均轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞中,分組如下：miR-146a mimics + Wt MIF, miR-146a mimics NC + Wt MIF, miR-146a mimics + Mut MIF, miR-146a mimics NC + Mut MIF。采用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)染的熒光素酶活性以及miR-146a和MIF 3'UTR基因的靶向關(guān)系。RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-146a mimic和NC后,MIF mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果1、miR-146a mimics + pGL3-MIF 3'UTR-Wt共轉(zhuǎn)染組的熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯弱于其他轉(zhuǎn)染組,差異有顯著性(p0.01)。然而,對(duì)于突變型載體pGL3-MIF 3'UTR-Mut,不同組的熒光強(qiáng)度沒有明顯區(qū)別(p0.05)；2、RT-PCR和Westerm blot結(jié)果示miR-146a模擬物轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞后,MIF蛋白和mRNA的表達(dá)量下調(diào)(P=0.0045,P=0.0041)。結(jié)論miR-146a可與MIF基因3'UTR靶向結(jié)合,控制MIF基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯,提供了MIF轉(zhuǎn)錄后翻譯的機(jī)制理論,可能為膠質(zhì)瘤的治療提供新的靶點(diǎn)。
[Abstract]:A new type of non - coding small RNA molecule - micro RNA ( miRNA ) , which is a kind of endogenous non - coding small molecule RNA ( about 17 - 20 nucleotides ) , is highly conserved in the course of evolution . It has been found that the expression of miR - 14s in human glioma is lower than that of normal neuroglia , and that the expression of miR - 14is lower than that of normal neuroglia . In conclusion , it is shown that the expression of miR - 14is lower than that of normal neuroglia . In this study , we collected 20 cases of glioma tissues and corresponding non - tumor normal brain tissues from June 2014 to July 2015 . The results showed that the expression levels of miR - 14and MIF in the tissues of glioma were significantly lower than those in normal tissues ( 0 . 68 鹵 0 . 05 ) vs ( 0.23 鹵 0.00 ) .
2 . RT - PCR showed that MIF mRNA was expressed in normal brain tissues and glioma tissues , and the level of MIF mRNA was significantly higher in glioma tissues than in normal brain tissues .
3 . Immunohistochemical results showed that MIF mRNA expression was significantly higher in glioma tissues than in normal tissues ( 0.89 鹵 0.02 ) vs . ( 5.49 鹵 0.48 ) , ( P 0.01 ) .
2 . MIF was mainly distributed in cytoplasm and was expressed in normal brain tissues and glioma tissues .
3 銆，

本文編號(hào)：2048535