本文關鍵詞：新型納米技術介導的miRNA的靶向遞送及其在腫瘤治療中的應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《北京工業(yè)大學》 2014年

新型納米技術介導的miRNA的靶向遞送及其在腫瘤治療中的應用

曹敏軍  

【摘要】：我國是食管癌和乳腺癌的高發(fā)地區(qū)。早期的食管鱗癌和乳腺癌主要以手術治療為主，晚期則以化學藥物治療為主。然而，化療藥物毒副作用大，易產(chǎn)生耐藥性，尋找新的有效治療方法仍是癌癥治療領域的研究熱點。microRNA（miRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類與基因表達調控緊密相關的非編碼小分子單鏈RNA，它們通過與靶mRNA的3'非編碼區(qū)特異性結合從而介導靶mRNA的降解或翻譯抑制，并進一步的調控基因的表達。miRNA的表達異常與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關。研究發(fā)現(xiàn)miRNA其本身亦具有癌基因或抑癌基因的作用。因此，能夠對腫瘤中miRNA表達進行干預的新技術，是當前腫瘤治療研究中的熱點領域，基于miRNA的基因療法也為腫瘤的治療提供了一個新機遇。然而miRNA的體內遞送是目前基于miRNA的新型藥物臨床應用的最大的挑戰(zhàn)。本論文分別以在食管鱗癌和乳腺癌中具有較強抑癌作用的miR-203和miR-34a為負載物，構建了多種用于miRNA投遞的納米載運系統(tǒng)。高效地將miRNA轉運至癌細胞和腫瘤組織內并發(fā)揮其抑癌作用。此外，還通過使用腫瘤靶向分子葉酸構建了具有乳腺癌腫瘤靶向的納米載運系統(tǒng)，并在動物體內水平驗證了其靶向性和抑制腫瘤活性。 本論文的具體工作包括以下幾個方面： 1、使用納米金剛石（Nanodiamond，ND）、魚精蛋白（Protamine，PS）和miR-203通過自組裝的方式制備了納米藥物miR-203/PS@NDs。該納米藥物以經(jīng)表面修飾的納米金剛石為基礎，通過氫鍵作用包裹上一層生物相容性較好的魚精蛋白，并在最外層通過極性作用吸附上miR-203。通過對納米材料的表征及電鏡觀察，驗證了通過自組裝形成的納米藥物miR-203/PS@NDs成功地吸附了miR-203且動力學尺寸保持在100nm左右；此外，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測miR-203負載效率實驗及納米材料表征實驗，優(yōu)化了制備miR-203/PS@NDs過程中使用的各組分的質量比，最終使用的質量比為miR-203:PS@NDs=1:4；通過模擬體內血清環(huán)境檢測了納米體系在血清存在的情況下能有效地維持miR-203的穩(wěn)定性，進一步的，通過模擬腫瘤細胞中的微酸性環(huán)境，檢測了納米體系在酸性環(huán)境中能有效地釋放miR-203。 2、分別通過體外細胞水平和裸鼠體內動物實驗評價了miR-203/PS@NDs的抑癌效果。細胞毒性實驗和轉染實驗證明了miR-203/PS@NDs的生物相容性和轉染效率要優(yōu)于傳統(tǒng)的脂質體轉染試劑PEI25K；進一步的細胞水平實驗驗證了通過納米體系轉染進入細胞內的miR-203能有效地抑制其靶基因Ran和ΔNp63的表達，并抑制了食管鱗癌細胞的增殖和遷移能力；裸鼠動物體內實驗則證明通過瘤內注射和尾靜脈注射的方式進入體內的miR-203/PS@NDs均能顯著地抑制食管癌的生長。相較于尾靜脈注射，瘤內注射顯示了更強的抑瘤效果。 3、使用能特異性結合乳腺癌細胞膜表面葉酸受體的葉酸分子（Folate acid，F(xiàn)A），通過層層自組裝的方式構建了具有腫瘤靶向功能的納米載運體系。在構建納米載體PS@NDs的基礎上，通過吸附miR-34a構建了初級攜載miR-34a的納米轉運載體。在此基礎上，通過極性作用在miR-34a/PS@NDs表面再次吸附上一層PS，使其表面帶上正電荷從而進一步的吸附上帶負電荷的FA。納米材料表征及透射電鏡觀察實驗驗證了通過層層自組裝的形式成功地構建了靶向納米藥物FA/PS/miR-34a/PS@NDs。通過模擬體內血清環(huán)境驗證了該納米載體在血清環(huán)境中能有效地維持miR-34a的穩(wěn)定性。此外，，在細胞水平上利用激光共聚焦顯微鏡及流式細胞儀技術驗證了該納米載體可以高效地將miR-34a轉染到乳腺癌細胞中。 4、分別通過體外細胞實驗及裸鼠體內實驗評價了靶向納米藥物FA/PS/miR-34a/PS@NDs抑癌作用和腫瘤靶向功能。miR-34a具有通過抑制靶基因Fra-1的表達，從而抑制細胞增殖、遷移和耐凋亡的能力。進一步的細胞增殖實驗、Transwell實驗和細胞凋亡實驗驗證了轉染FA/PS/miR-34a/PS@NDs后，乳腺癌細胞的增殖、遷移能力和耐凋亡能力顯著降低。通過瘤內注射和尾靜脈注射兩種方式對接種了乳腺癌細胞的裸鼠進行給藥，實驗結果表明兩種注射方式均能顯著抑制腫瘤的生長。小動物活體成像系統(tǒng)觀察實驗表明，通過尾靜脈注射給藥的FA/PS/miR-34a/PS@NDs能有效地富集在腫瘤組織中。 本研究通過自組裝的方式成功地構建了能高效地將miR-203載運進入食管鱗癌細胞中的基于納米金剛石的納米載體。生物學活性評價表明miR-203/PS@NDs在食道癌細胞中表現(xiàn)出較強的抑癌活性。此外，通過層層自組裝的方式成功地構建了最外層包裹有葉酸分子的靶向納米藥物FA/PS/miR-34a/PS@NDs，體外細胞實驗和裸鼠體內實驗結果表明FA/PS/miR-34a/PS@NDs不僅具有抑癌作用，同時還具有腫瘤靶向功能。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：北京工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R730.5
【目錄】：

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本文編號：202449