肺癌是所有癌癥相關死亡的主要原因之一。事實上,單獨的肺癌死亡超過了接下來三種最普遍的癌癥死亡(結腸癌,乳腺癌和前列腺癌)的總和。肺癌的預后不良部分是由于在早期疾病進展期間缺乏任何明顯癥狀的晚期診斷。此外,在NSCLC中鑒定的包括突變,擴增,缺失和融合在內的多種基因改變加重了信號通路和生理活性的異常。因此,探究治療肺癌的有效靶點迫在眉睫。近幾十年的研究表明有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑轉導許多不同的信號,從而產(chǎn)生了廣泛的細胞反應,包括細胞增殖,分化,存活,遷移,神經(jīng)元功能和免疫應答。Raf激酶(Rapidly Accelerated Fibrosarcoma)是逆轉錄病毒致癌基因,它調控細胞的分化、轉化、生長和凋亡等諸多生命過程,Raf-MEK-ERK通路是細胞信號傳導的一條主干通路,這條通路的異常調控是細胞癌變的主要原因之一。RAF激酶的生理調節(jié)是復雜的,并涉及幾個步驟,包括蛋白質與蛋白質之間的相互作用,磷酸化,去磷酸化和構象變化。且C-RAF作為MAPK通路中的主要樞紐蛋白,其功能及結合蛋白對肺癌的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。KAP1是人源TRIM基因家族的成員,并且與其它三種TRIM蛋白(TIF1α,TIF1γ和TIF1δ)高度相關。KAP1是正常發(fā)育和分化的關鍵調節(jié)物;缺乏KAP1的小鼠在預處理前死亡,而在成年前腦中特異性缺失KAP1的小鼠表現(xiàn)出更高水平的焦慮和應激誘導的學習及記憶的改變。KAP1還參與維持多能性,是小鼠胚胎干細胞的終末分化所必需的,并且已經(jīng)與促進和抑制不同成人細胞類型的分化相關。KAP1在正常和腫瘤細胞的增殖和分化中起關鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)C-RAF可以特意結合KAP1;實驗檢測了臨床肺癌組織及鄰近正常肺組織中KAP1的表達水平,實驗發(fā)現(xiàn)KAP1在肺癌組織中高表達。在細胞實驗中,利用CRISP/cas9技術成功的在肺癌A549細胞株中成功敲除KAP1,并進行了 rescue實驗。實驗發(fā)現(xiàn)敲除KAP1后,細胞增殖率顯著降低;在化療藥物敏感中發(fā)現(xiàn)敲除KAP1后A549細胞對順鉑及5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性顯著增加,且發(fā)現(xiàn)低濃度的5-FU基本不會促進A549細胞的凋亡,敲除KAP1后細胞明顯發(fā)生凋亡;通過western blot實驗檢測野生A549細胞、rescue細胞及敲除KAP1細胞確定了敲除KAP1后,ERK會被異常激活;劃痕及transwell實驗發(fā)現(xiàn)敲除KAP1后細胞遷移受到顯著抑制;成球實驗發(fā)現(xiàn)敲除KAP1成球率顯著降低,且western blot顯示細胞干性標志物明顯降低;軟瓊脂克隆形成發(fā)現(xiàn)敲除KAP1后克隆形成數(shù)目及大小顯著減少;血管形成發(fā)現(xiàn)敲降KAP1后,血管形成能力顯著下降;EMT轉化實驗發(fā)現(xiàn)敲除KAP1后,細胞轉化能力明顯減弱;流失細胞術顯示細胞周期受到顯著抑制;移植瘤實驗表明敲除KAP1后裸鼠移植瘤的體積及重量明顯減小;裸鼠體重明顯增加;AKO組移植瘤的增殖速度明顯慢于A549組。移植瘤HE染色顯示:A549組較AKO組相比,腫瘤細胞形態(tài)不規(guī)則,胞核肥大、呈藍色深染、核分裂相多見,偶見腺腔樣結構。本研究表明KAP1在肺癌細胞A549中具有重要作用,敲除后細胞增殖生長、細胞干性、侵襲遷移能力、血管形成能力及細胞周期受到抑制,且會異常磷酸化ERK,提高A549細胞對5-FU的敏感性。目前對于C-RAF及KAP1在肺癌發(fā)生發(fā)展的作用還很少,本研究對于它們在肺癌發(fā)病機制中的作用進行了初步探索,為臨床治療肺癌提供理論依據(jù)和新的作用靶點。
【學位授予單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

相關刊論文 前1條

1 Chun-Ting Cheng;Ching-Ying Kuo;David K Ann;;KAPtain in charge of multiple missions: Emerging roles of KAP1[J];World Journal of Biological Chemistry;2014年03期

本文編號：2013193