本文選題：垂體腺瘤 + 乳酸脫氫酶A��； 參考：《第三軍醫(yī)大學》2017年博士論文

【摘要】：垂體腺瘤(pituitary adenoma,PA)是顱內(nèi)常見的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(約占顱內(nèi)腫瘤10-15%),多起源于垂體前葉,患者臨床表現(xiàn)為腫瘤壓迫以及腫瘤引起的激素異常分泌導致的癥狀。PA為單克隆起源的良性腫瘤,雖然其在組織學上為良性,但是部分腫瘤侵襲浸潤瘤周組織,呈侵襲性生長,為侵襲性PA。侵襲性PA在生物學行為上更偏向于惡性,且有較強的增殖能力,手術(shù)難以完全切除且術(shù)后易復發(fā),患者預后差。因此研究調(diào)控PA侵襲性發(fā)生的分子機制,探索治療侵襲性PA的新方法具有很現(xiàn)實的臨床意義。“瓦伯格效應(yīng)”指出:腫瘤細胞糖代謝顯著高于正常細胞,即使在氧氣充足條件下腫瘤細胞也偏向于通過無氧酵解產(chǎn)生能量,這種異常增高的糖酵解與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。乳酸脫氫酶A(Lactate dehydrogenase A,LDHA)是糖酵解的關(guān)鍵酶之一,其在多種惡性腫瘤中呈高表達,并且調(diào)控腫瘤的增殖、侵襲等惡性生物學行為。同時有報道PA的葡萄糖攝取能力顯著高于正常垂體,大腺瘤攝取葡萄糖的能力較微腺瘤顯著增高。這些證據(jù)強烈提示PA增殖侵襲等生物學行為可能與異常糖代謝的密切相關(guān)。為了探究LDHA在侵襲性PA發(fā)生發(fā)展中的的作用及機制,我們首先在PA臨床病理標本中檢測LDHA的基因及蛋白表達,并且結(jié)合臨床資料分析LDHA蛋白水平與腫瘤侵襲增殖等生物學行為的相關(guān)性;在PA細胞系中探究了LDHA的生物學作用及相應(yīng)機制;在PA裸鼠模型中體內(nèi)驗證LDHA的作用;選用LDHA特異性化學抑制劑草氨酸鹽(oxamate)在PA細胞系、體內(nèi)動物模型及原代細胞層面探索了其對于PA侵襲及增殖的影響及相關(guān)機制。最后我們在PA細胞系GH3中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于臨床的抗糖尿病藥物二甲雙胍(Metformin,Met)顯著下調(diào)了LDHA基因表達,因此我們進一步利用GH3細胞系及原代PA細胞探究了Met在PA增殖中的作用。通過以上研究我們初步闡明LDHA在侵襲性PA發(fā)生發(fā)展中的作用,并且探索了可能應(yīng)用于侵襲性PA治療的新方法,以期為侵襲性PA臨床診斷及治療開辟新的方向。實驗方法:第一部分選取PA臨床手術(shù)標本,利用q RT-PCR和免疫組化的方法分別檢測LDHA在腫瘤標本中基因及蛋白的表達。并且結(jié)合臨床病例資料分析LDHA蛋白表達與PA侵襲及增殖能力的相關(guān)性。第二部分體外培養(yǎng)GH3垂體腺瘤細胞系,慢病毒轉(zhuǎn)染細胞上調(diào)LDHA表達,比色法檢測各組細胞乳酸產(chǎn)生,行transwell及CCK8實驗檢測各組細胞的侵襲及增殖能力,并且利用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡及周期分布,western-blot檢測各組細胞相關(guān)蛋白表達。第三部分選取不同濃度LDHA特異性化學抑制劑oxamate處理GH3細胞,比色法及2-NBDG分別檢測各組細胞乳酸產(chǎn)生及葡萄糖吸收,transwell及CCK8實驗檢測各組細胞的侵襲及增殖能力,流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布與凋亡,選用活性氧(Reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒測定各組細胞ROS的產(chǎn)生,利用JC-1染色法檢測各組細胞線粒體膜電位的變化,western-blot檢測各組細胞線粒體凋亡途徑相關(guān)調(diào)控蛋白的表達。建立PA荷瘤裸鼠動物模型,在體研究oxamate對PA體內(nèi)生長的影響及相關(guān)機制。選取PA臨床手術(shù)標本,培養(yǎng)并鑒定原代PA細胞,oxamate處理原代細胞后檢測不同處理組細胞的侵襲及增殖能力。第四部分選用不同濃度Met處理GH3細胞,CKK-8實驗檢測不同處理組細胞增殖活性,流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期分布及凋亡,同時對Met處理組細胞行基因芯片分析篩選差異表達基因,對Met誘導GH3細胞凋亡機制進行初步探討,最后在原代PA細胞中驗證Met對PA增殖活性的影響。實驗結(jié)果:1.LDHA在侵襲性PA中高表達,且與腫瘤的增殖活性正性相關(guān)(1)侵襲性PA的LDHA表達水平在m RNA及蛋白層面均顯著高于非侵襲性PA。(2)LDHA的蛋白表達與增殖指數(shù)Ki-67呈正相關(guān)(p0.05)。2.LDHA促進GH3細胞糖酵解、侵襲及增殖(1)GH3細胞中過表達LDHA可以促進細胞乳酸產(chǎn)生及葡萄糖轉(zhuǎn)運體-1(GLUT-1)的蛋白表達。(2)GH3細胞中過表達LDHA可以促進細胞侵襲及侵襲相關(guān)的調(diào)控蛋白(MMP-2)表達。(3)GH3細胞中過表達LDHA激活AKT,抑制了GSK3β活性,上調(diào)了細胞周期調(diào)控蛋白Cyclin D1表達,促進了細胞周期進展,但是對細胞凋亡無明顯影響。3.特異性LDHA抑制劑oxamate對PA細胞系GH3、體內(nèi)PA及原代PA細胞糖酵解、侵襲及增殖的影響(1)oxamate顯著降低了GH3細胞乳酸產(chǎn)生、葡萄糖吸收及GLUT-1蛋白表達。(2)oxamate顯著降低了GH3細胞侵襲能力并且下調(diào)侵襲相關(guān)的調(diào)控蛋白(MMP2)的表達。(3)oxamate顯著降低了GH3細胞增殖活性。(4)oxamate抑制GH3細胞AKT活性,活化了GSK3β活性,下調(diào)了細胞周期調(diào)控蛋白Cyclin D1表達,阻滯細胞周期于G0/G1期。(5)oxamate誘導了GH3細胞凋亡,促進了細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生,降低細胞線粒體膜電位,上調(diào)了Bax及Cleaved-Caspase3蛋白表達,抑制了Bcl-2蛋白表達。ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)可以逆轉(zhuǎn)oxamate的促凋亡作用。(6)上調(diào)LDHA促進GH3細胞體內(nèi)增殖,oxamate顯著抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長。(7)上調(diào)LDHA顯著促進體內(nèi)腫瘤Cyclin D1及MMP2蛋白表達,oxamate抑制了Cyclin D1及MMP2蛋白表達并且促進了凋亡信號分子Cleaved-Caspase3表達。(8)oxamate顯著抑制了原代PA細胞的侵襲及增殖活性。4.Met抑制GH3細胞及原代PA細胞增殖(1)Met顯著抑制GH3細胞增殖活性。(2)干擾GH3細胞ATF3顯著降低了Met誘導的凋亡信號分子Cleaved-Caspase3的蛋白表達。(3)Met有效抑制了原代PA細胞的增殖活性。結(jié)論:1.LDHA在侵襲性PA中通常表達上調(diào),且表達水平與腺瘤的增殖活性呈正相關(guān)。2.過表達LDHA可以促進GH3細胞糖酵解及侵襲,通過調(diào)控AKT-GSK3β-Cyclin D1信號通路可以促進GH3細胞周期進展進而促進細胞增殖。3.特異性LDHA抑制劑oxamate可以有效抑制GH3細胞糖酵解及侵襲,通過調(diào)控AKT-GSK3β-Cyclin D1信號通路阻滯GH3細胞周期進展及ROS介導的線粒體凋亡途徑促進GH3細胞凋亡。4.Met可以有效抑制PA細胞增殖。
[Abstract]:In order to investigate the role and mechanism of LDHA in the development of invasive PA , it is suggested that the effect of LDHA in the development of invasive PA is significantly higher than that of normal cells . In this paper , the expression of cell cycle and proliferation of the cells were detected by using reactive oxygen species ( ROS ) assay . The results showed that : 1 . The expression of LDH in GH3 cells was significantly lower than that of non - invasive PA . ( 4 ) oxamate inhibits the activity of GH3 cells , activates GSK3 beta activity , down - regulates the expression of cyclin D1 in GH3 cells , blocks cell cycle in G0 / G1 phase .
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R736.4

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本文編號：2000162