本文選題：次氯酸 + 熒光探針��； 參考：《山東大學》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景和研究目的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)是一種有氧代謝的副產物,主要包括超氧負離子,過氧化氫和羥基自由基,它們在生物體內都具有不同的靶向物。ROS不僅能夠通過損傷脂類,蛋白質和DNA誘導疾病的發(fā)生,同時也能夠作為信號分子調節(jié)生理和病理過程。次氯酸(Hypochlorousacid,HOCl)是生物體內重要的活性氧之一,在體內主要由髓過氧化物酶和血管過氧化物酶1(Vascularperoxidase-1,VPO1)催化產生,能夠與多種物質如蛋白質,脂類,核酸等發(fā)生化學修飾反應。HOCl在人類免疫功能系統(tǒng)中發(fā)揮重要功能,在炎癥部位HOCl濃度會明顯增加,有助于對入侵細菌和病原體進行破壞。但是,次氯酸或次氯酸鹽濃度過高會導致組織損傷和一系列疾病,如動脈硬化、關節(jié)炎甚至誘發(fā)癌癥等。因此設計合成具有專一性強、靈敏性高的新型HOCl熒光探針,建立應用于細胞內HOCl的熒光顯微成像方法,以實現對細胞內次氯酸濃度變化的實時監(jiān)測是非常必要的。然而,到目前為止,能夠用于檢測HOCl的比率型熒光探針仍然少之又少。所報道的大部分HOCl熒光探針都是單一發(fā)射光譜,輸出的熒光信號很容易受到探針濃度,儀器敏感性等環(huán)境條件的干擾。因此設計合成一些新型有效的HOCl熒光探針具有重要的科學意義和應用前景。近年來,癌癥的發(fā)病率和死亡率逐年增加,已經成為中國人口的主要死因和重大公共衛(wèi)生問題。2015年,約400萬新發(fā)癌癥病例和300萬癌癥死亡病例發(fā)生在中國,其中肺癌是最為常見的癌癥發(fā)生和最主要的癌癥死亡原因。全球最新癌癥統(tǒng)計數據也顯示,在2012年,全球有約1.41千萬新發(fā)癌癥病例,820萬患者死于癌癥。其中57%的癌癥病例以及65%的癌癥死亡病例來自發(fā)展中國家。不論是發(fā)達還是發(fā)展中國家,肺癌是男性的首位癌癥死因。肺炎是許多下呼吸道疾病以及肺癌早期所出現的一個關鍵特征,主要是由于肺吸入大量過敏原,環(huán)境污染物,微生物固定繁殖和吸煙所致。同時肺炎會引起吞噬細胞聚集,產生大量殺菌物質。其中產生的ROS和活性氮(RNS)發(fā)揮著關鍵作用。此外肺炎癥部位也有MPO的存在。異常濃度的HOCl能夠誘導細胞凋亡或直接引起細胞壞死。研究發(fā)現,HOCl或MPO/H2O2/Cl-系統(tǒng)可使體外肺細胞或體內肺組織中3-氯酪氨酸和脂過氧化產物等的水平升高。HOCl能夠使A549細胞發(fā)生誘變。因此,要抑制或治療稱之為癌癥之首的肺癌,亟需開發(fā)新型抗肺癌細胞增殖的藥物,本課題組針對次氯酸新合成了一系列新型熒光次氯酸探針,并從化學遺傳學的角度出發(fā),找到能夠明顯抑制A549細胞生長的小分子,初步研究其抑制A549細胞生長的機制,可以為抗癌藥物的研發(fā)提供新思路,為藥物靶點尋找提供新線索。研究方法1)點掃描共聚焦顯微鏡檢測HOCl探針細胞內的發(fā)光效果和光穩(wěn)定性;2)倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài);3)SRB法檢測細胞存活率;4)LDH法檢測細胞壞死;5)Hoechst33258染色檢測細胞凋亡;6)吖啶橙(AO)染色法檢測細胞核斷裂;7)免疫印跡實驗分析PARP切割水平;8)TUNEL染色法檢測細胞凋亡;9)體視顯微鏡分析 CAN(7-Diethylamino-3-(2,3-dihydro-1H-perimidin-2-yl)-chromen-2-one,7-二乙氨基-3-(2,3-二氫-1H-perimidin-2-基)-苯并吡喃-2-酮)對雞胚尿囊膜(Chick chorioallantoic membrane,CAM)中腫瘤細胞成瘤性和血管生成的影響;10)螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒檢測Nrf2酶活性;11)MPO(Myeloperoxidase)試劑盒檢測細胞內HOC1水平變化。實驗結果1)CAN等新型HOCl熒光探針在細胞內具有良好的發(fā)光特性和光穩(wěn)定性;2)CAN能夠檢測RAW264.7細胞中HOCl水平;3)CAN不與線粒體或溶酶體共定位;4)CAN不影響人臍靜脈血管內皮細胞增殖;5)CAN體外誘導A549細胞凋亡;6)CAN通過誘導細胞凋亡抑制腫瘤細胞生長;7)CAN促進Nrf2酶活性增加;8)CAN降低A549細胞內HOCl水平。實驗結論利用RAW264.7細胞,我們驗證了 CAN等一系列新型HOCl熒光探針在細胞中具有良好的發(fā)光效果和光穩(wěn)定性,除CAN可以誘導RAW264.7細胞死亡不適宜在細胞中檢測HOCl,其他探針都可以用于檢測RAW264.7細胞中內源性的HOCl水平。此外,CAN能夠顯著抑制A549細胞生長并誘導細胞凋亡,但是對血管內皮細胞存活率沒有影響,進一步我們以雞胚尿囊膜為模型,利用TUNEL染色證明,在體內CAN可以通過細胞凋亡抑制腫瘤細胞生長,但是對正常的CAM血管生成沒有作用。CAN能夠降低細胞內HOCl水平,這說明CAN可以通過直接螯合HOCl降低A549細胞內HOCl水平,或者影響MPO酶活性以降低細胞內HOCl生成水平,誘導A549細胞凋亡;此外CAN也可能通過降低HOCl,影響Nrf2酶活性,進一步打破ROS平衡或影響HOCl理化修飾功能,最終誘導A549細胞凋亡。
[Abstract]:The research background and research purpose reactive oxygen species ( ROS ) is a by - product of aerobic metabolism , which mainly includes superoxide anion , hydrogen peroxide and hydroxyl radical , which can be used as signal molecule to regulate physiological and pathological process . A series of novel fluorescent hypochlorite probes were synthesized in the study group for hypochloral acid . From the perspective of chemical genetics , we found the mechanism of inhibiting the growth of A549 cells . We verified that a series of novel HOCl fluorescent probes , such as CAN , have good luminescence effect and photostability in cells . In addition , CAN can induce RAW264.7 cell death , it is not suitable to detect HOCl in RAW264.7 cells .
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R73-36

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本文編號：1989906