本文選題：肝細胞癌 + 預(yù)后　； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma. HCC)的發(fā)病率位列全球第六,全球每年新發(fā)病例782,500,死亡病例達745,500之多,占所有成人肝臟惡性在腫瘤的75%-90%3。具有發(fā)病隱匿,惡性程度高、易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)等特點,預(yù)后不良,是一種嚴重威脅人們健康的疾病。目前,肝癌的的治療方法主要包括肝切除和肝臟移植4。經(jīng)腫瘤切除治療5年后有近70%的病例出現(xiàn)復(fù)發(fā),肝臟移植是患有小的多發(fā)性腫瘤以及嚴重肝功能障礙的肝癌患者的一線治療方案。對適合于肝臟移植最佳患者,患者接受治療后5年生存率較高、術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)的概率較低。但是供肝來源短缺是這種治療方法的主要阻礙,很多患者在等待肝源過程中發(fā)生死亡。目前,肝細胞癌發(fā)生發(fā)展的確切分子機制還不明確。因此,從分子水平開展對肝癌發(fā)病機制的深入探討,對探索新的靶向治療途徑、改善肝癌預(yù)后意義深遠。Phenazine biosynthesis-like domain-containing protein (PBLD)又稱為MAWBP,最早在2001年由Iriyama等人利用酵母雙雜交技術(shù)從人的肝臟cDNA庫中分離發(fā)現(xiàn)7,是一類近年來發(fā)現(xiàn)的相對較新的分子蛋白。作為phenazine biosynthesis-like protein蛋白家族的唯一代表,PBLD廣泛分布于人的大腦、心臟、肺臟、肝臟、胰腺和腎臟等各種組織中。已有研究發(fā)現(xiàn),PBLD的表達水平在胰島素抵抗、葉酸缺乏癥和高血壓等一些疾病中升高8。但是,該分子在人體各組織及其在各種腫瘤發(fā)生發(fā)展中的具體生物學(xué)功能及其發(fā)揮作用的分子機制目前還沒有研究報道。當前的研究,關(guān)于該分子的有限認識僅僅來源于基因組和蛋白組學(xué)海量、籠統(tǒng)的篩選結(jié)果中。作為強有力的分子生物學(xué)技術(shù),基因組學(xué)及蛋白組學(xué)技術(shù)現(xiàn)在已被廣泛用于各種疾病尤其是腫瘤相關(guān)新型分子標志物的篩選中,對疾病的早期診斷和有效分子靶向治療的發(fā)展發(fā)揮了舉足輕重的作用9。近年來,越來越多的基因和蛋白組學(xué)的研究提示我們PBLD在肝癌組織中的表達與正常肝組織相比普遍降低。這種現(xiàn)象提示我們PBLD表達的缺失與肝癌發(fā)生發(fā)展可能有一定相關(guān)性。然而,目前還沒有深入、系統(tǒng)的研究來探索PBLD在肝細胞癌組織中的表達特征、生物學(xué)作用及發(fā)揮作用的分子機制。因此,本研究將從肝癌組織標本入手,首先對PBLD在肝癌組織中的表達分布及其與肝癌患者臨床特征、預(yù)后間的關(guān)系進行分析,進而利用分子生物學(xué)實驗探索PBLD在體內(nèi)和體外對肝癌細胞株增殖、細胞周期分布、侵襲等生物學(xué)行為的作用,最后利用基因組學(xué)對PBLD發(fā)揮生物學(xué)作用的下游相關(guān)信號通路進行初步探索。方法1.肝癌組織中PBLD表達分布及與患者預(yù)后情況分析(1) 肝癌標本的收集：所有標本均取自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院肝膽外科手術(shù)切除的肝癌及邊緣組織(經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準,且征求并獲取患者及其家屬同意)。(2) 肝癌組織中PBLD的檢測：利用免疫組織化學(xué)、western blot和實時熒光定量PCR方法檢測肝癌組織中PBLD的表達水平,并與各肝癌組織對應(yīng)的癌旁肝組織進行比較,同時利用實時熒光定量PCR比較了不同分化程度的肝癌組織中PBLD的表達差異。(3) PBLD表達水平與肝癌患者臨床特征及預(yù)后間關(guān)系的分析：收集108例肝癌患者的臨床特征,分別利用X2檢驗分析PBLD與肝癌患者各臨床特征之間的關(guān)系,利用回歸分析分析了PBLD對肝癌患者預(yù)后的預(yù)測價值,同時,利用Kaplan-Meier法分析PBLD與肝癌患者生存、無瘤生存時間的關(guān)系。PBLD與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系進一步由另一獨立隊列進行驗證。2.體外檢測PBLD對肝癌細胞株生物學(xué)行為的影響(1) PBLD對肝癌細胞增殖的影響為研究PBLD對肝癌細胞株增殖能力的作用,我們首先利用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達或者沉默肝癌細胞株中PBLD的表達。利用CCK-8法將穩(wěn)定過表達PBLD的HepG2_ PBLD和Huh7_ PBLD細胞及其相應(yīng)的空載對照細胞以相同的數(shù)量分別接種于96孔板中,待細胞貼壁后每隔24小時隨機選取5孔進行CCK-8檢測,連續(xù)檢測至72小時。同時,我們將HepG2_ PBLD和Huh7_ PBLD及其對應(yīng)的空載對照細胞分別接種于10cm培養(yǎng)皿中,14天后進行染色、計數(shù)分析,利用平板克隆觀察PBLD過表達后對肝癌細胞株增殖能力的影響。(2) PBLD對肝癌細胞侵襲、遷移能力的影響。為研究PBLD對肝癌細胞株侵襲和遷移能力的作用,將等量的HepG2_ PBLD和Huh7_ PBLD及其空載對照細胞分別接種于含有基質(zhì)膠和無基質(zhì)膠的transwell小室中,48小時后結(jié)晶紫染色、計數(shù),利用transwell小室觀察PBLD過表達后和敲低后肝癌細胞株侵襲(含基質(zhì)膠)、遷移(無基質(zhì)膠)能力。(3) PBLD對肝癌細胞株細胞周期分布的影響。為明確PBLD過表達所引起的肝癌細胞株增殖抑制作用是否與細胞周期相關(guān),我們利用PI染色分別對HepG2_ PBLD和Huh7_ PBLD及其對應(yīng)的空載對照細胞進行DNA標記,進而利用流式細胞技術(shù)對兩組肝癌細胞的周期分布進行分析,并與空載細胞進行對比,分析PBLD過表達對肝癌細胞株細胞周期分布的影響。3.體內(nèi)檢測PBLD對肝癌細胞株增殖、血管生成能力的作用(1) PBLD對肝癌細胞增殖能力的作用：4-6周BALB/c雄性裸鼠在隨機分為PBLD過表達細胞組和空載對照細胞組。分別將等量PBLD過表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞和對照細胞注入裸鼠皮下,觀察并測量皮下移植瘤的生長直徑來檢測PBLD對肝癌細胞增殖的作用。(2) PBLD對肝癌細胞血管形成能力的影響：取裸鼠皮下成瘤組織,固定、脫水、包埋后進行免疫組織化學(xué)檢測血管內(nèi)皮標志性指標CD31的表達,并鏡下計數(shù)不同細胞來源的肝癌組織中微血管的形成數(shù)量來分析PBLD對肝癌細胞血管形成能力的影響。4. PBLD發(fā)揮生物學(xué)作用的分子機制研究(1) PBLD下游基因的篩選：通過真核表達載體轉(zhuǎn)染構(gòu)建PBLD過表達HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株,運用基因組學(xué)技術(shù)篩選并分析PBLD過表達后與空載對照細胞之間的差異基因譜。(2) PBLD下游靶基因及相關(guān)信號通路的初步篩選：通過對所有差異基因進行功能聚類及富集分析,篩選出PBLD潛在的下游靶基因及可能調(diào)控的信號通路。(3) PBLD對相關(guān)信號通路調(diào)控的驗證：1) PBLD對肝癌細胞EMT通路的影響利用細胞免疫熒光檢測PBLD過表達細胞株中上皮細胞標記物E-cadherin及間質(zhì)細胞標記物N-cadherin的表達,western-blot檢測裸鼠皮下成瘤組織中兩者的表達。同時,利用western-blot分別檢測PBLD過表達和沉默后肝癌細胞株中EMT相關(guān)指標的變化。最后,在82例肝癌標本中對PBLD和E-cadherin的表達水平的關(guān)系進行驗證。2) PBLD對ERK/MAPK信號通路的影響利用ERK通路抑制劑U0126抑制ERK/MAPK信號通路活性,檢測pERK的表達情況,進而對添加U0126的肝癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力的變化情況進行檢測。3) PBLD對HIFla/VEGF-A的影響利用細胞免疫熒光檢測PBLD過表達細胞株中VEGF-A的表達變化,利用cck8法檢測在VEGF對PBLD過表達細胞株增殖能力的影響,進一步利用western-blot技術(shù)檢測常氧和缺氧條件下PBLD對肝癌細胞中VEGF和及其上游調(diào)控因子HIFla表達水平的影響。結(jié)果1. PBLD在肝癌組織中的表達存在顯著降低或缺失本研究中免疫組織化學(xué)染色和western blot檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤組織PBLD較對應(yīng)的癌旁正常肝組織表達顯著下降；實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)108例肝癌患者中有92例患者(84.4%)肝癌組織中PBLD mRNA的表達水平存在不同水平的降低,肝癌組織中的平均表達水平顯著低于癌旁組織(P0.001)。同時,隨肝癌組織的分化程度的降低PBLD表達水平逐漸降低。2. PBLD的表達水平與肝癌患者的預(yù)后顯著相關(guān)PBLD的表達水平與肝癌患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系顯示：PBLD的表達水平與肝癌組織的分化程度(P=0.017)及腫瘤的AJCC分期(P=0.038)密切相關(guān),PBLD表達水平越高,肝癌組織的分化程度越高,AJCC分期越早。另外,PBLD高表達組肝癌患者的無瘤生存時間(RFS)和總體生存時間(OS)均顯著高于低表達組患者。多變量分析顯示,PBLD表達水平是患者術(shù)后RFS (HR 0.502,95% CI 0.282-0.891, P= 0.019)和OS (HR 0.364,95% CI 0.138-0.957, P= 0.04)的獨立預(yù)測指標。同時,我們利用組織芯片檢測進一步對上述結(jié)論進行了驗證,Kaplan-Meier生存分析顯示PBLD的表達水平與RFS (P= 0.012)和OS(P=0.032)顯著相關(guān),多因素分析結(jié)果顯示PBLD是肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)(HR 0.490,95% CI 0.285-0.841, P= 0.010)和生存(HR 0.528,95% CI 0.303-0.922, P= 0.025)的獨立預(yù)測指標。3.體外實驗中PBLD可抑制肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移我們成功構(gòu)建了肝癌細胞Huh7和HepG2的PBLD穩(wěn)定過表達細胞株。CCK-8結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組細胞貼壁后的24、48、72小時,PBLD過表達均可顯著抑制肝癌細胞的增殖能力(P0.05)。平板克隆實驗結(jié)果同樣顯示：PBLD穩(wěn)定過表達的HepG2和Huh7兩種肝癌細胞各組之間細胞在克隆形成數(shù)量上均具有顯著性差異(816.67 vs 316.67,P0.001; 736.33 vs 257.00, P0.001).流式細胞術(shù)觀察PBLD對細胞周期的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PBLD過表達使肝癌細胞發(fā)生G2期和S期阻滯。Transwell實驗顯示PBLD過表達后可顯著抑制HepG2和Huh7細胞的遷移、侵襲能力,而反向敲低驗證實驗結(jié)果與過表達實驗結(jié)果相一致。4.裸鼠成瘤實驗中PBLD可抑制HepG2細胞的增殖和血管形成HepG2_PBLD細胞在裸鼠皮下形成腫瘤的平均體積在不同測量時間點均小于HepG2_vector組。實驗結(jié)束HepG2_PBLD與HepG2_vector兩組細胞形成腫瘤的最大體積差距達3倍左右。同時,利用免疫組織化學(xué)的方法檢測裸鼠皮下成瘤組織中血管內(nèi)皮細胞標志物CD31的表達情況,結(jié)果顯示,來源于PBLD過表達細胞株的腫瘤組織其CD31的表達量顯著低于來源于空載對照細胞的腫瘤組織(3.4 vs 5.4,P0.05)。因此,PBLD可顯著抑制肝癌細胞在裸鼠體內(nèi)的增殖能力和微血管形成的能力。5. PBLD可能通過調(diào)控EMT、ERK/MAPK和HIF1α/VEGF-A等多條腫瘤相關(guān)信號通路發(fā)揮抑癌作用(1) 我們首先通過基因組學(xué)檢測來分析穩(wěn)定過表達了PBLD的HepG2細胞株與空載對照的細胞相比其基因表達譜的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PBLD過表達后發(fā)生表達差異的基因涉及細胞增殖、細胞周期、細胞侵襲和遷移、細胞粘附、血管生成等多種細胞功能相關(guān)的基因,進一步對這些差異基因所涉及的相關(guān)信號通路進行分析,結(jié)果顯示,PBLD過表達后發(fā)生顯著改變的信號通路包括MAPK EMT及NF-κ B等,提示我們PBLD可能通過這些信號通路發(fā)揮生物學(xué)作用。(2) PBLD抑制肝癌細胞的EMT細胞免疫熒光和western-blot檢測結(jié)果顯示：在PBLD穩(wěn)定過表達的HepG2細胞株及來源于該細胞株的裸鼠成瘤組織中,作為上皮細胞標志的指標E-cadherin表達減少,而作為間充質(zhì)細胞標志的N-cadherin的表達顯著減少。82例肝癌組織實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,在肝癌組織中PBLD的表達水平與E-cadherin存在顯著正相關(guān)(r=0.61,P=0.000),PBLD表達水平越高,其所對應(yīng)的E-cadherin的表達水平也越高。western-blot檢測E-cadherin重要調(diào)控因子發(fā)現(xiàn),PBLD可顯著抑制E-cadherin上游調(diào)控因子snail的表達,進而抑制肝癌細胞的EMT。(3) PBLD抑制肝癌細胞中ERK/MAPK信號通路對PBLD過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞和裸鼠成瘤組織中pERK的檢測結(jié)果顯示,PBLD過表達后可顯著抑制pERK的表達,同時,使用ERK抑制劑U0126后,肝癌細胞的增殖能力和侵襲、遷移能力同樣受到顯著抑制。(4) PBLD通過HIF1α/VEGF-A抑制肝癌細胞的血管生成細胞免疫熒光結(jié)果顯示：PBLD過表達之后HepG2細胞中VEGF-A的表達被顯著抑制。PBLD在24、48、72小時均可顯著抑制肝癌細胞的增殖能力,同時,在加入VEGF-A 48小時開始,這種增殖的抑制作用開始被VEGF-A所逆轉(zhuǎn)。因此,PBLD可通過抑制VEGF-A的表達來抑制肝癌細胞的增殖能力。同時,western-blot檢測發(fā)現(xiàn),PBLD可顯著抑制常氧和缺氧狀態(tài)下肝癌細胞HIF1α以及VEGF-A的表達水平。結(jié)論1. PBLD在肝癌組織中普遍存在表達缺失現(xiàn)象。2. PBLD的表達與肝癌的分化程度和臨床分期存在相關(guān)性,PBLD可作為判斷肝癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測指標：PBLD表達水平越低預(yù)示患者生存時間越短,復(fù)發(fā)率越高,預(yù)后越差。3. PBLD在可抑制肝癌細胞的生長、侵襲和遷移能力,在裸鼠體內(nèi)可抑制肝癌細胞的增殖和血管形成能力。4. PBLD可能通過EMT、MAPK等多條腫瘤相關(guān)信號通路調(diào)控肝癌細胞的生物學(xué)行為。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 吳孟超;;肝癌外科治療的近期進展[J];中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志;2006年02期

2 張志敏;;肝癌會遺傳嗎?[J];肝博士;2006年03期

3 徐連根;周晶;雷偉;沈志祥;;瘦素及其受體在肝癌組織中的表達及意義[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2006年05期

4 魏麗珍;李勝棉;張楠;溫登瑰;周燁;王士杰;;688例肝癌患者發(fā)病特點及診療狀況分析[J];肝臟;2010年02期

5 ;我國科研人員發(fā)現(xiàn)促進肝癌生長和轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因[J];臨床薈萃;2010年10期

6 吳生;;盤點誘發(fā)肝癌的7大元兇[J];肝博士;2012年01期

7 鄧慶華;一家四例肝癌報道[J];中國廠礦醫(yī)學(xué);1995年06期

8 王定珠;;觥籌交錯 過度疲勞 肝癌乘機而入[J];健康博覽;2005年11期

9 笑山,吳蓉蓉;喝咖啡可以減少肝癌發(fā)生率[J];健康之路;2005年04期

10 ;遠離肝癌 預(yù)防在先[J];農(nóng)民文摘;2006年02期

相關(guān)會議論文 前10條

1 俞順章;穆麗娜;;飲水中藻類毒素與肝癌關(guān)系和控制的研究(摘要)[A];全國腫瘤流行病學(xué)和腫瘤病因?qū)W學(xué)術(shù)會議論文集[C];2007年

2 楊秉輝;;肝癌預(yù)防的新話題-非酒精性脂肪性肝病與肝癌[A];第十二屆全國肝癌學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

3 丁光偉;楊玉秀;徐秋霞;徐存拴;;肝癌多基因表達異常初步研究[A];第五屆全國肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

4 吳孟超;;肝癌外科治療的近期進展[A];第三屆全國重型肝病及人工肝血液凈化學(xué)術(shù)年會論文集（上冊）[C];2007年

5 劉耕陶;孫華北;方亞南;;肝癌發(fā)生的化學(xué)預(yù)防[A];第十次中國生物物理學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2006年

6 阮秀花;田蔥;張效本;張喜梅;;肝癌患者乙型肝炎病毒感染血清流行病學(xué)分析[A];第五屆全國肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

7 阮秀花;田蔥;張效本;張喜梅;;肝癌患者乙型肝炎病毒感染血清流行病學(xué)分析[A];第五屆全國肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

8 呂巖;韓學(xué)鋒;;肝癌患者需求的評估[A];中華醫(yī)學(xué)會醫(yī)學(xué)工程學(xué)分會第八次學(xué)術(shù)年會暨《醫(yī)療設(shè)備信息》創(chuàng)刊20周年慶祝會論文集[C];2006年

9 孫華;魏懷玲;劉耕陶;;雙環(huán)醇對化學(xué)毒物促發(fā)肝癌的防治作用及作用機制研究[A];2009醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十一屆全國腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

10 謝靜媛;戴煒;涂愛民;趙文高;符花;胡應(yīng)龍;;深圳地區(qū)53例肝癌發(fā)生的相關(guān)因素探討[A];全國第2屆中西醫(yī)結(jié)合傳染病學(xué)術(shù)會議暨國家中醫(yī)藥管理局第1屆傳染病協(xié)作組會議論文匯編[C];2008年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 湖北宜昌 胡獻國;吸煙與肝癌[N];上海中醫(yī)藥報;2013年

2 四川成都 孫清廉;遠離肝癌 謹防四大危險因素[N];上海中醫(yī)藥報;2013年

3 特約撰稿 北京朝陽醫(yī)院京西院區(qū)肝膽外科主任 孫文兵;警惕肝癌的過度治療[N];醫(yī)藥導(dǎo)報;2007年

4 健康時報特約記者 孫理;三招不得肝癌[N];健康時報;2008年

5 葉建平;專家提醒肝癌患者保護生命 重在“三早”防治[N];中國中醫(yī)藥報;2008年

6 通訊員 韋夏 本報記者 鄧宏鷹 鐘少鴻;不良飲食習(xí)慣易誘發(fā)肝癌[N];中國食品報;2009年

7 記者 顧泳;我國肝癌患者占全球55%[N];解放日報;2010年

8 解放軍302醫(yī)院 劉士敬;四成肝癌酒精泡出來的[N];健康時報;2010年

9 記者 顏維琦 曹繼軍;我科學(xué)家揭示肝癌發(fā)生早期分子機制[N];光明日報;2012年

10 記者 胡德榮;肝癌發(fā)生早期階段分子機制被揭示[N];健康報;2012年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 陳放;TOPK蛋白和肝癌發(fā)生以及相關(guān)調(diào)控機制的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

2 張怡安;中樞神經(jīng)特異性RNA結(jié)合蛋白NOVA1在肝癌中的表達及其促進腫瘤發(fā)展的潛在分子機制探究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

3 殷杰;E3泛素連接酶Prp19對肝癌侵襲的影響及其機制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

4 周宇紅;分化抑制因子ID1在調(diào)控化療誘導(dǎo)的肝癌細胞“干性”改變中的作用研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

5 王盛;FOXA1基因變異和調(diào)控異常促，

本文編號：1972309