發(fā)布時間：2018-05-31 03:00

  本文選題：原發(fā)性肝癌 + 細胞因子誘導的殺傷細胞　； 參考：《南方醫(yī)科大學》2015年博士論文

【摘要】：背景和目的原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一,其起病隱匿、且發(fā)展迅猛,我國每年死于原發(fā)性肝癌的患者約11萬例數,其死亡率已上升為農村和城市惡性腫瘤死亡率的第一位和第二位。在我國,肝癌的誘發(fā)因素主要為乙型肝炎病毒感染,約有80%-90%的肝癌患者攜帶乙型肝炎病毒,其余誘發(fā)因素包括丙型肝炎病毒感染、酒精肝及黃曲霉素等。目前,手術切除仍然被認為是根治HCC的重要手段之一。然而,大部分HCC患者診斷時已屬于中晚期,統(tǒng)計結果表明HCC患者中僅有約15%的患者適合行手術切除治療。且較之其他惡性腫瘤,HCC存在其特殊的生物學行為,包括肝硬化背景、多中心癌前病變的存在、早期即能侵犯門靜脈及發(fā)生肝內轉移等。在合并肝硬化肝臟功能儲備下降的情況下,患者往往難以承受外科手術；且針對肝內多發(fā)病灶的情況,外科手術難以對病灶一一切除,上述原因大大的限制了外科手術在HCC中的應用。因此,近年來以經動脈導管栓塞化療(Transcatheter aterial chemoembolization, TACE)和射頻消融(Radiofrequency Ablation)等為代表的微創(chuàng)治療越來越受到人們的關注。與傳統(tǒng)外科手術相比,微創(chuàng)治療能夠最大限度的保存正常肝臟組織同時達到治療腫瘤的目的。目前,TACE序貫消融治療聯合多吉美靶向治療已成為治療肝癌的基本模式。然而,盡管微創(chuàng)治療在一些早期肝癌的治療中取得了長足的進步,HCC的5年生存率并沒有得到明顯的改善,大部分患者在接受外科手術、射頻消融等根治性治療后往往出現腫瘤復發(fā)、轉移。正如其他腫瘤一樣,HCC中似乎也存在著一小部分具有不定向分化和自我更新能力的干細胞,即腫瘤干細胞。國外學者Reya等早年間提出腫瘤干細胞的觀點,認為腫瘤通常由正常的干細胞轉化而來,且這部分細胞往往對放化療不敏感,是腫瘤發(fā)生復發(fā)、轉移的根源。因而,尋找能針對靶向腫瘤干細胞的治療是提高患者手術療效,延長患者生命的關鍵。為了更進一步的研究腫瘤干細胞的特性并將其作為一個未來靶向治療的靶點,腫瘤干細胞的分離及鑒定成為了一個重點。近幾年來,關于肝癌干細胞標志物的報道逐漸增多,其中包括CD133、EpCAM、CD13、CD4、CD90、CD24等。盡管從各個實驗室分離得到的帶有這些標志物的細胞都具有相似的干細胞特性,但目前尚未有公認的肝癌干細胞標志物。Nanog基因是一種在內細胞團、原始生殖細胞以及胚胎干細胞表達的轉錄因子。近年來發(fā)現,Nanog基因不僅在維持胚胎干細胞的全能型方面起著重要作用,而且在多種腫瘤中均有表達,其中包括乳腺癌、膀胱癌、腦膠質瘤等。且Nanog還是一個預后預測因子,Nanog表達越強,則臨床預后越差。研究發(fā)現Nanog不僅在多種腫瘤于細胞中表達,且還是維持腫瘤干細胞自我更新能力及多向分化潛能的重要因子。國內學者shan等利用Nanog啟動子攜帶外源性GFP報告基因的慢病毒載體分離得到了一小群Nanog陽性的肝癌細胞,并證實了這部分細胞具有干性的特征,包括干性基因的上調及自我更新能力等。因此,我們借鑒這種方法并構建了LV-PNanog-GFP-T2A-Luc慢病毒載體,借此在體內外實驗中能更直觀的觀察肝癌干細胞。近年來,免疫治療的快速發(fā)展給腫瘤治療帶來了曙光。其中,細胞因子誘導的殺傷細胞(Cytokine induced killer cells, CIK cells)能在體外大量擴增,具有強大的抗瘤效應。CIK細胞是由人外周血單個核細胞(PBMC)在體外經多種細胞因子(包括CD3單抗、IL-2、IFN-γ等)刺激擴增后得到的一群異質性細胞,其主要的效應細胞為CD3/CD56雙陽性細胞,因為同時具有T細胞及NK細胞的表型特征,它又被成為NK細胞樣的T淋巴細胞。較之其他過繼性免疫治療,CIK細胞體外增值速度快,且具有非MHC限制性殺瘤特點,已在臨床上得到廣泛的運用。目前,CIK細胞過繼性免疫治療已被綜合運用于腫瘤治療當中,特別是在臨床上評價腫瘤達到CR (Complete response)或在腫瘤根治性手術后。在肝癌的臨床應用中,已有文獻報道CIK聯合手術或者微創(chuàng)治療能顯著提高患者生存率、降低腫瘤術后復發(fā)率。眾所周知,腫瘤干細胞是腫瘤復發(fā)、轉移的根源。然而,CIK細胞是否通過殺傷肝癌干細胞從而降低肝癌術后復發(fā)率卻不得而知,且CIK細胞免疫治療降低肝癌術后復發(fā)率的相關機制均未見文獻報道。本文旨在探討CIK細胞對肝癌干細胞的影響及其機制,為CIK聯合微創(chuàng)及手術治療提供堅實的理論基礎。方法第一部分CIK細胞培養(yǎng)體系建立及體外抑瘤活性探討1.健康成人外周血中單個核細胞(PBMC)的分離,采集健康成人新鮮血液后利用淋巴細胞分離液將其分離。依次加入不同的細胞因子包括抗CD3單抗、IFN-γ、PHA以及IL-2等進行擴增、培養(yǎng)；2.CIK細胞的表型檢測,收集不同天數的CIK細胞,孵育針對不同細胞表型的流式熒光抗體后利用流式細胞儀檢測其表面標志；3.CCK8實驗檢測培養(yǎng)成熟的CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷效應；4.平板克隆實驗檢測CIK細胞對腫瘤細胞增殖能力的影響；5. Transwell及Boyden小室實驗檢測CIK細胞對腫瘤細胞遷移、侵襲能力的影響；6.腫瘤成球實驗檢測CIK細胞對腫瘤細胞成球能力的影響；7.統(tǒng)計分析該部分使用GraphPad Prism5進行繪圖,采用SPSS20.0軟件對實驗結果進行統(tǒng)計學分析,計量資料以均數±標準差(x±s)表示。兩組樣本均數比較采用兩獨立樣本t檢驗(Two sample t-test),若方差不齊,則采用校正t檢驗法。多組樣本均數比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),若方差齊不性,則采用Walch法進行校正,對照組與實驗組的的多重比較采用Dunnett test。以P0.05認為有統(tǒng)計學差異。第二部分CIK細胞對肝癌干細胞的殺傷作用探討1.構建LV-PNanog-GFP-T2A-Luc質粒2.質粒提取、純化3.穩(wěn)定細胞株建立將pMD2.G、psPAX2和目的質粒共同轉染293T細胞,生產慢病毒,感染肝癌細胞,建立穩(wěn)定攜帶PNanog-GFP-T2A-Luc的肝癌細胞株。4.流式細胞儀分析GFP陽性細胞的比例,小動物活體成像儀體外檢測Luc信號5.流式細胞儀分選出GFP陽性及GFP陰性的腫瘤細胞。5.提取GFP陽性及GFP陰性腫瘤細胞的RNA,按照按照TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書,逆轉錄成cDNA后,qRT-PCR檢測干性相關基因表達水平。6.通過平板克隆實驗、成球能力分析及Transwell及Boyden小室實驗鑒定GFP陽性細胞干性特征。7.CCK8實驗比較CIK細胞對GFP陽性及GFP陰性的腫瘤細胞的殺傷效率。8. Time-Lapse實驗直觀觀察CIK細胞與腫瘤細胞及腫瘤球之間相互作用的過程。9. NOD/SCID小鼠皮下成瘤實驗。10.小鼠成瘤后,每兩天予以不同比例CIK細胞治療,同時游標卡尺檢測腫瘤體積、小動物活體成像儀檢測Luc信號變化。11.組織層面上檢測瘤組織中CIK細胞相關CD5、CD56分子的表達。12.免疫組化檢測瘤組織增殖相關指標BrdU、Ki67及干性相關指標GFP的表達。13.統(tǒng)計學分析該部分使用GraphPad Prism5進行繪圖,采用SPSS20.0軟件對實驗結果進行統(tǒng)計學分析,計量資料以均數±標準差(x±s)表示。兩組樣本均數比較采用兩獨立樣本t檢驗(Two sample t-test),如果對照組為常數,則采用單樣本t檢驗(One sample t-test),若方差不齊,則采用校正t檢驗法。多組樣本均數比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),若方差齊不性,則采用Walch法進行校正,對照組與實驗組的的多重比較采用Dunnett test。小鼠治療期間Luc信號檢測和腫瘤體積的比較的采用重復測量設計資料的方差分析。以P0.05認為有統(tǒng)計學差異。第三部分CIK細胞殺傷腫瘤干細胞相關機制探討1.NKG2D阻斷實驗CIK細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)前使用NKG2D抗體進行阻斷封閉30分鐘后,再與腫瘤細胞相互作用,后續(xù)相關平板克隆、CCK8、腫瘤成球培養(yǎng)等驗證NKG2D分子的功能。2.TUNEL檢測細胞凋亡腫瘤細胞與CIK細胞按一定比例共培養(yǎng)4小時后,PBS漂洗去多余的CIK細胞,再按凱基TUNEL試劑盒說明行TUNEL檢測。3. ELISA檢測CIK細胞釋放的細胞因子將腫瘤細胞與CIK細胞按1：10的比例共培養(yǎng)24小時后,留取培養(yǎng)上清以ELISA方法檢測細胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10等。4.統(tǒng)計學分析該部分使用GraphPad Prism5進行繪圖,采用SPSS20.0軟件對實驗結果進行統(tǒng)計學分析,計量資料以均數±標準差(x±s)表示。多組樣本均數比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),若方差齊不性,則采用Walch法進行校正,樣本均數間的多重比較采用LSD法；如方差不齊,多重比較采用Dunnett's T3法。CIK細胞殺傷GFP陽性腫瘤細胞效應的比較采用析因設計資料的方差分析。以P0.05認為有統(tǒng)計學差異。結果第一部分CIK細胞培養(yǎng)體系的建立及體外抑瘤活性探討1.CIK細胞的誘導擴增及表型檢測健康成人外周血單個核細胞經過多種細胞因子共同刺激后,于3天后細胞開始形成集落。隨著培養(yǎng)時間延長,細胞數量迅速增加,而且集落增多、增大,在此過程中,細胞體積開始增大。經過2周的培養(yǎng)時間后,CIK細胞數量可達到8×108左右,細胞計數較培養(yǎng)前擴增約50倍左右,培養(yǎng)過程中臺盼藍染色檢測活細胞比例均在95%以上。我們通過流式細胞儀監(jiān)測不同天數CIK細胞表型,隨著培養(yǎng)天數增加,CIK細胞主要效應細胞CD3/CD56雙陽性細胞比例顯著增加,由第七天4.7±2.5%到第21天增加至55.2±13.2%。同時,CD8陽性細胞比例也顯著增加(D7：69.1±5.1%D21：92.1±2.9%),而CD4陽性細胞比例則逐漸減少(D7：25.6±4.7%；D21：2.7±1.0%)。我們還檢測了CIK細胞表面NKG2D分子的表達,NKG2D分子由第七天73.1±3.0%到第21天增加至92.1±2.9%。2.CIK細胞能夠明顯抑制肝癌細胞增殖CCK8實驗結果顯示,CIK細胞對腫瘤細胞具有明顯的抑制作用,且隨著CIK作用比例升高,其抑制作用更明顯,其抑瘤率在1：5時為58.3±1.5%(SMMC7721)和67.3±2.5%(Huh7),而在1：50時升高至86±2.0%(SMMC7721)和94±2.0%(Huh7)。平板克隆實驗顯示,在1：5,1：10,1：30三個比例作用后,兩個細胞株克隆形成能力分別下降了45%,72.9%,92.4%(SMMC7721)和43.4%,80%,92.2%(Huh7)。方差分析顯示具有統(tǒng)計學差異(F=59.644,P0.001；F=65.519,P0.001)。3.CIK細胞處理后,肝癌細胞遷移、侵襲能力下降,且成球能力下降CIK細胞不止抑制腫瘤細胞增殖,我們還發(fā)現CIK細胞處理過后的肝癌細胞遷移侵襲能力及成球能力均有一定的下降。Transewell及Boyden小室實驗顯示,與CIK細胞共培養(yǎng)24小時后,肝癌細胞的遷移能力分別下降了83.5%(SMMC7721)和58.1%(Huh7),而侵襲能力下降了58.7%(SMMC7721)和82%(Huh7),兩獨立樣本t檢驗顯示具有統(tǒng)計學差異(t=6.945,P=0.001;t=6.743, P0.001; t=13.6635 P0.001; t=8.265, P=0.001)(表1-2,圖1-5)。而同時通過腫瘤球培養(yǎng),CIK處理后的肝癌細胞成球能力也有一定程度的下降,在1：10和1：30兩個比例時,其成球能力分別下降了36.8%,87.2%(SMMC7721)和40.9%,89.2%(Huh7),方差分析顯示具有統(tǒng)計學差異(F=81.214, P0.001; F=70.813, P0.001)。第二部分CIK細胞對肝癌干細胞的殺傷作用探討1.穩(wěn)定表達LV-PNanog-GFP-T2A-Luc的肝癌細胞株的建立及其干性鑒定為了進一步驗證CIK細胞對肝癌干細胞的殺傷活性,我們構建了LV-PNanog-GFP-T2A-Luc慢病毒載體。建立穩(wěn)定HCC細胞株后,通過流式細胞儀檢測兩個穩(wěn)定細胞株SMMC7721及Huh7 GFP陽性細胞比例分別約為5.3%及3.9%(圖2-1B)。同時,我們還利用小動物活體成像儀檢測SMMC7721細胞株Luc信號,在104水平可檢測到Luc信號表達,且與細胞數量呈正相關。建立穩(wěn)定細胞株后,我們通過qRT-PCR方法檢測了常見的干細胞相關基因,發(fā)現GFP陽性細胞干性基因表達明顯上調,包括Nanog, Oct4, Sox2,兩獨立樣本t檢驗顯示具有統(tǒng)計學差異(P均小于0.05)。接下來,我們對分選出來的GFP陽性細胞進行成球能力分析。發(fā)現GFP陽性細胞具有更強腫瘤成球能力,其成球能力是GFP陰性細胞的2.6倍左右,兩獨立樣本t檢驗顯示具有統(tǒng)計學差異(t=13.714,P0.001)。而同時通過Transwell和Boyden小室實驗,我們發(fā)現GFP陽性細胞具有更強的遷移、侵襲能力,兩獨立樣本t檢驗顯示具有統(tǒng)計學差異(t=14.442, P=0.004; t=6.189, P=0.003)。而克隆形成實驗也得到相符的結果,GFP陽性細胞的克隆形成能力約為GFP陰性細胞的2.5倍(t=10.575；P=0.00)。通過體外實驗,我們發(fā)現GFP陽性的腫瘤細胞干性基因表達上調,具有更強的腫瘤成球能力、遷移侵襲能力及克隆形成能力。2.CIK細胞體外殺傷GFP陽性細胞及腫瘤球再對GFP陽性細胞功能做了初步驗證后,我們利用CCK8實驗驗證了CIK細胞對GFP陽性及GFP陰性細胞之間的殺傷效應,結果發(fā)現,CIK細胞對兩者殺傷效率并無明顯差異(F=0.201, P=0.66; F=0.465, P=0.505)。為了更進一步動態(tài)觀察CIK細胞與腫瘤細胞、腫瘤球之間作用的過程,我們使用Time-Lapse技術拍攝了相關的視頻。隨著拍攝時間延長,腫瘤細胞(包括GFP陽性細胞)由于趨化作用周圍CIK細胞逐漸增多,最后被CIK細胞包圍并攻擊,形成細胞團塊。而在CIK細胞與腫瘤球相互作用的視頻中可見,腫瘤球由一開始規(guī)則、圓潤的球體,逐漸被CIK細胞攻擊、吞噬,最后被CIK細胞裂解,而且其綠色熒光信號逐漸減弱。通過體外殺傷實驗及視頻結果,我們初步證實了,CIK不僅能夠殺傷普通腫瘤細胞,而且其對以GFP陽性為代表的腫瘤干細胞也具有一定的殺傷作用。3.CIK細胞體內殺傷GFP陽性細胞為了更進一步驗證CIK細胞對腫瘤干細胞的殺傷作用,我們利用攜帶LV-PNanog-GFP-T2A-Luc的肝癌細胞株SMMC7721行皮下成瘤后使用不同比例CIK細胞治療小鼠。結果顯示大劑量CIK細胞治療組小鼠腫瘤體積較空白對照組顯著降低(P0.05),且瘤重顯著降低(F=4.615,P=0.027)。通過小動物活體成像,我們發(fā)現,與空白對照組相比,CIK細胞治療組較空白對照組Luc信號顯著降低,重復測量設計資料的方差分析顯示組間有顯著差異(F=17.206,P0.001),第9天開始,CIK細胞治療組Luc信號較空白對照組顯著降低(P0.05)。Luc信號強度間接反應著腫瘤內干細胞含量,CIK細胞治療能顯著降低Luc信號,預示著CIK細胞治療在小鼠體內對干細胞也有一定的殺傷效應。我們取材后通過免疫組化對以上結論進行進一步的驗證。首先,通過CIK細胞表面特異性的標志CD5、CD56染色,我們證實了CIK細胞確實到達了瘤體。而后,通過免疫組化實驗我們發(fā)現CIK細胞治療組增殖相關指標BrdU、Ki67標記陽性細胞比例均較空白對照組下降(F=1065.06, P0.001; F=387.165,P0.001)。且GFP陽性細胞比例較空白對照組顯著下降(F=39.857,P=0.004),說明CIK細胞在小鼠體內不僅能抑制腫瘤增殖,還對腫瘤干細胞具有一定的殺傷作用,這與Luc信號檢測結果相符。第三部分 CIK細胞對肝癌干細胞的殺傷機制探討1.NKG2D受體阻斷后,CIK細胞對GFP陽性細胞殺傷效應下降,且腫瘤細胞增殖、成球能力回復通過CCK8殺傷實驗,我們發(fā)現使用抗體將CIK細胞表面的NKG2D配體封閉后,CIK細胞殺傷GFP陽性腫瘤細胞效應顯著下降。析因設計資料的方差分析顯示不同分組間具有顯著差異(F=24.953,P0.001; F=46.369, P0.001).克隆形成實驗及腫瘤成球實驗顯示,使用抗體阻斷CIK細胞表面NKG2D分子后,腫瘤細胞的克隆形成能力及成球能力均得到一定的回復,單因素方差分析顯示具有統(tǒng)計學差異(F=22.282, P=0.002; F=31.903, P=0.001); (F=16.884, P=0.003; F=17.889, P=0.003)。2.CIK細胞誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡通過TUNEL檢測,我們發(fā)現在經過CIK細胞處理4個小時后,腫瘤細胞包括GFP陽性腫瘤細胞均發(fā)生明顯的凋亡。3.CIK細胞釋放細胞因子ELISA檢測通過ELISA檢測,我們發(fā)現CIK與腫瘤細胞共培養(yǎng)釋放大量的IFN-y,其釋放濃度分別達到295.3±22.7Pg/ml與88.4±4.2Pg/ml,其他細胞因子包括IL-2、 TNF-αIL-4、IL-6、IL-10等雖有釋放,然而其釋放濃度較低。結論1.外周血單個核細胞經過多種細胞因子誘導后可培養(yǎng)成為成熟的CIK細胞,且主要效應細胞CD3/CD56雙陽性細胞比例在培養(yǎng)2-3周后達到高峰；同時,隨著培養(yǎng)時間延長,CIK細胞表面NKG2D分子比例增加。2.體外實驗表明,培養(yǎng)成熟的CIK細胞對普通腫瘤細胞具有較明顯的殺傷作用,且殺傷效應與CIK細胞呈劑量梯度關系,作用比例越大,其抑瘤效果更明顯。3.CIK細胞處理后,HCC遷移侵襲能力下降,同時兩個HCC細胞株成球能力均有不同程度下降。而腫瘤成球能力是反映腫瘤中干細胞含量多少的一個重要指標,且通過直觀觀察腫瘤球與CIK細胞之間的相互作用也可以發(fā)現,CIK可以趨向并攻擊腫瘤球。間接反映出,CIK細胞有可能對肝癌干細胞也有一定的殺傷作用。4.利用GFP標記Nanog表達后分選得到的GFP陽性細胞具有較強的干性特征,包括干性基因上調、成球能力、遷移侵襲能力增強等；5.體外實驗證實,CIK細胞對這部分以GFP陽性為代表的腫瘤干細胞同樣具有較強的殺傷效應。6. NOD/SCID小鼠體內實驗證實,CIK細胞不僅能抑制腫瘤增殖,且對干細胞也具有殺傷效用。7.目前,CIK細胞抗瘤作用的機制尚未十分明確。我們通過體外實驗證實,CIK細胞可通過表面NKG2D分子與腫瘤細胞表面相應配體結合后殺傷靶細胞。而這也可能是CIK細胞殺傷腫瘤干細胞的一個重要機制。同時,CIK細胞還能誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡,包括GFP陽性具有干性特征的腫瘤干細胞。CIK細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)后能分泌大量的IFN-γ從而起到抑瘤效果。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

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本文編號：1958022