本文選題：肝細胞癌 + 微血管侵犯��； 參考：《第二軍醫(yī)大學》2017年碩士論文

【摘要】：【研究背景與目的】肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)在全球范圍內是第五大常見惡性消化道腫瘤,并且是世界范圍內癌癥死亡的第三大原因,其發(fā)病率和死亡率近年來逐漸上升。目前手術切除和肝移植被公認為是肝細胞癌最好的治療方法,但由于復發(fā)和轉移的高發(fā)生率,HCC患者的預后仍然無法令人滿意。肝癌的血管侵犯被認為是由腫瘤表達的一種具有侵略性的生物學行為,是目前預測肝癌復發(fā)的最關鍵因素之一。MVI(microvascular Invasion,MVI)作為血管侵犯的一種特殊類型,存在于肝癌發(fā)展過程中一個特殊的中間階段,其通過侵犯門靜脈或肝靜脈分支形成肝內復發(fā)或全身轉移,從而影響患者預后。然而國際及國內諸多學者對MVI的定義、分級尚存在爭議,并且鑒于肝癌MVI在評價組織特性、預后以及治療方面仍存在很大的異質性,因而目前對于MVI的診斷仍然依賴于術后的病理檢測。很多研究者從影像學,病理學,血清學等方面進行大量的研究,發(fā)現(xiàn)了很多指標均與MVI的發(fā)生相關,但鑒于這些指標在MVI的預測有效率方面還較低,因而限制了臨床運用,探索有效的生物標志物提高術前MVI的預測診斷正確率也就成為了目前MVI研究領域的熱點。循環(huán)腫瘤細胞(Circulating tumor cells,CTCs)是存在于外周血中的各類腫瘤細胞的統(tǒng)稱,因自發(fā)或診療操作從實體腫瘤病灶滲入到周圍組織脫落到外周血液循環(huán),大部分CTCs會在機體的作用下發(fā)生凋亡,少部分能夠逃逸免疫系統(tǒng)并發(fā)生遠處轉移。相關研究證實,CTCs存在于惡性腫瘤形成遠處轉移性病灶的中間過程,與患者的臨床預后關系密切相關,可以成為預測腫瘤患者預后的一個較為可靠的輔助因子,甚至有研究者提出將CTCs檢測加入到現(xiàn)有的肝癌臨床分期指標,進而提高肝臟腫瘤術后轉移及復發(fā)的預后評估能力。近年來,伴隨著生物研究技術的進步,外周血中CTCs的富集、分離、鑒定技術逐漸建立成熟。本實驗室通過前期相關研究發(fā)現(xiàn)肝癌CTCs檢出和CTCs個數(shù)與肝臟腫瘤直徑大小、是否發(fā)生大血管侵犯(門靜脈癌栓)、TNM的臨床分期等均緊密相關,并且研究表明CTCs影響HCC術后患者的預后。但關于CTCs與血管侵犯的另一特殊類型MVI兩者之間是否具有相關性,目前還尚未有相關報道。因此我們就CTCs與MVI之間是否具有相關性展開了進一步深入研究。在本研究我們進一步優(yōu)化了的肝癌CTCs分離和鑒定技術,在分離方面運用Ficoll密度梯度離心結合磁性激活細胞分選術(Magnetic activated cell separation,MACS)富集肝癌CTCs,通過標記CD45單克隆抗體的免疫磁珠陰性分選去除肝癌患者外血液中的淋巴細胞。陰性分選法與陽性分選法相比降低了腫瘤特異性對富集CTCs的影響。在選取進一步鑒定肝癌CTCs的標志物方面,我們嘗試了很多指標,發(fā)現(xiàn)有肝癌細胞特異性表達的去唾液酸糖蛋白受體(Asialoglycoprotein receptor,ASGPR)和氨甲酰磷酸合成酶1(Carbamy phosphate synthetase 1,CPS1)的混合指標在鑒定肝癌CTCs方面特異性及敏感性都較高。經過前期預實驗驗證,建立多色免疫熒光染色方法后,我們采集HCC患者的外周血液檢測術前CTCs,并通過術后病理HE染色確定是否發(fā)生MVI,最終結合臨床病理資料,探討CTCs在術前肝癌MVI預測運用中的臨床價值,以期為后續(xù)進一步研究針對肝癌CTCs及MVI的個體化治療提供了理論依據�！狙芯糠椒ā�1.建立多色細胞免疫熒光染色技術富集、分離、鑒定、計數(shù)肝癌CTCs:采集所有患者5m L外周血(采用含EDTA的5m L抗凝管),通過Ficoll-Paque PLUS分離液進行密度梯度離心后,用磁性標記的抗CD45單克隆抗體提取表達CD45的白細胞來富集肝癌CTCs。用離心涂片機將富集到的細胞分在多聚賴氨酸玻片上制成細胞涂片,人去唾液酸糖蛋白受體(Asialoglycoprotein receptor,ASGPR)和氨甲酰磷酸合成酶1(carbamoyl phosphate synthetase 1,CPS1)小鼠單克隆抗體和大鼠抗人CD45單克隆抗體的混合物共孵育,再用兔抗小鼠-Alexa Fluor647 Ig G,山羊抗大鼠-Cy3作為二抗孵育,隨后用DAPI染色。通過熒光顯微鏡評估染色的載玻片。ASGPR+CPS1陽性,DAPI陽性,CD45陰性,且符合形態(tài)學特征的細胞記為CTCs。采用上述方法檢測108例肝癌患者CTCs表達情況,并計數(shù)CTCs。2.病理標本HE染色判斷肝癌患者MVI發(fā)生:根據《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南(2015版)》,將MVI定義為顯微鏡下可見的微小靜脈(中央靜脈、門靜脈分支或包膜外小靜脈)內漂浮有成團癌細胞且周邊有明確的血管內皮細胞環(huán)繞。對所有患者腫瘤組織固定,切邊制作成病理切片,對所有的病理切片進行HE染色,通過顯微鏡下觀察,依據指南鑒別有無MVI發(fā)生。3.統(tǒng)計分析CTCs與MVI之間的相關性:收集并統(tǒng)計肝癌患者臨床及病理資料,對納入檢測的108例肝癌患者檢測、鑒定CTCs并計數(shù)。連續(xù)變量以平均值加減標準差表示。分類變量表示為頻率和百分比,單因素分析方法采用χ2檢驗,多因素分析用Logistic回歸分析,以確定與微血管侵犯發(fā)生的獨立相關相關因素,并使用ROC曲線(Receiver Operating Characteristic Curve,ROC)檢驗并比較各因素的臨床效能。以雙側檢驗作為檢驗標準,P0.05認為具有統(tǒng)計學意義,所有的統(tǒng)計分析均采用SPSS 18.0軟件�！狙芯拷Y果】1、ASGPR+CPS1/CD45鑒定指標可用于分離、富集、鑒定出樣本中的肝癌CTCs,是一種可靠有效的方法,而基于多色免疫熒光染色技術建立的CTCs鑒定方法可以用于準確得判定肝癌CTCs表達。檢測結果顯示24例肝癌患者中有18例可以檢測出ASGPR(+)+CPS1(+)/CD45(-)細胞,檢出率為75%。12例其他惡性腫瘤患者(2例食管癌,2例胃癌,4例膽囊癌,3例結腸癌和1例乳腺癌)以及10名健康志愿者的外周血中,未檢測出ASGPR(+)+CPS1(+)/CD45(-)細胞。2、肝癌患者術前每5ml血中CTC數(shù)目檢出平均值36±24個。術后病理證實44例HCC患者為MVI(+),其中男性30例,女性14例;64例患者為MVI(-),其中男性41例,女性23例。CTC(+)患者64例,血清AFP400μg/L患者49例,腫瘤直徑5cm的44例,腫瘤數(shù)目單發(fā)的51例,腫瘤多發(fā)的57例�；诟伟┗颊咄庵苎惺欠駲z測出CTCs將患者分成兩組(CTC(+)和CTC(-)組)�；颊咄庵苎蠧TC(+)與MVI的表達,腫瘤數(shù)目,DCP40m Au/m L及前白蛋白≤170mg/L顯著相關,差異有統(tǒng)計學意義,但與其他臨床病理特征沒有顯著相關性。3、MVI(+)患者44例,CTC(+)檢出33例,檢出率為75%;MVI(-)患者64例,CTC(+)檢出18例,檢出率28%�；颊咝g前外周血液中的CTC(+)檢出率高于MVI(-)患者差異具有統(tǒng)計學意義(P0.001),MVI(+)陽性患者與MVI(-)陰性患者相比,前者發(fā)生CTCs的可能更大。4、將本研究的108例患者的臨床病理參數(shù)進行單因素回歸分析,結果提示:CTC(+),AFP400μg/L,DCP40m Au/m L、腫瘤直徑和腫瘤數(shù)目是MVI發(fā)生的獨立危險因素。而多因素Logistic回歸分析結果提示:CTC(+)、AFP400μg/L、DCP40m Au/m L和腫瘤直徑是MVI發(fā)生的獨立危險因素。5、為了評價各因子的預測價值,使用了ROC曲線來分析他們的靈敏性和特異性。CTC(+)的ROC曲線下面積為0.73,靈敏性為75%,特異性為71.9%,并且其ROC曲線下面積明顯高于單個因素如:AFP400μg/L,DCP40m Au/m L、腫瘤直徑。此外,CTC(+)、AFP400?g/L、DCP40m Au/m L和腫瘤直徑組合后進行多因素分析時生成的ROC曲線下面積為0.86,靈敏性為84.38%,特異性為72.37%�！狙芯拷Y論】本研究建立的多色免疫熒光染色方法可靠實用,可用于肝癌CTCs術前分離鑒定。HCC患者外周血中檢測出CTCs與其MVI的發(fā)生密切相關,CTCs能較好的術前預測MVI的發(fā)生,并為后續(xù)進一步研究針對肝癌CTCs及MVI的個體化治療提供了理論依據。
[Abstract]:In recent years , the diagnosis of hepatocellular carcinoma ( MVI ) is considered to be one of the most important factors to predict the prognosis of hepatocellular carcinoma . In this paper , we used Ficoll density gradient centrifugation combined with magnetic activated cell separation ( MACS ) to enrich the CTCs of liver cancer . The expression of CTCs in liver cancer patients was determined by means of fluorescence microscope . The correlation between CTCs and MVI was determined by means of fluorescence microscope . P 0.05 was considered statistically significant , and all statistical analysis was performed with SPSS 18.0 software . The results showed that the detection rate of CTC ( + ) in peripheral blood of patients with liver cancer was significantly higher than that of MVI ( - ) . The results suggested that CTC ( + ) , AFP400渭g / L , DCP40m Au / m L and tumor diameter were independent risk factors of MVI .
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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本文編號：1928765