本文選題：肝癌 + microRNA�。� 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC,以下簡稱肝癌)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和病死率分居全球惡性腫瘤的第5位和第3位。肝癌發(fā)病隱匿,早期診斷困難,預(yù)后差且極易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā),這也嚴(yán)重影響了肝癌的治療效果。肝癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的分子機(jī)制復(fù)雜且尚未完全清楚。MiRNA是近年來在真核生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種非編碼的單鏈小分子RNA,miRNA高度保守,在體內(nèi)主要起轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控作用。研究已證實miRNA在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。MiR-709在多種器官組織如腦、淋巴結(jié)、心臟、肺、肝臟和腎臟中含量豐富。MiR-709在肝癌中的作用還未見報道。因此,miR-709在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中的功能作用及其機(jī)制值得我們深入去研究。目的:探究miR-709在HCC發(fā)生發(fā)展過程中的作用。方法:運(yùn)用qRT-PCR檢測肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、肝癌組織及癌旁正常組織檢測miR-709水平,分析miR-709與肝癌臨床病理特征間關(guān)系。將miR-709 mimic和miR-709 inhibitor轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞中,檢測miR-709的表達(dá),分別采用CCK-8增殖實驗、Transwell遷移實驗和western blot實驗檢測轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞株的增殖、周期、遷移及侵襲能力的變化情況。然后通過運(yùn)用生物信息學(xué)軟件進(jìn)一步檢測miR-709的靶基因,然后通過熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)、qRT-PCR以及western Blot等方法驗證miR-709的作用靶點(diǎn)。結(jié)果:(1)①M(fèi)iR-709在肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào):通過應(yīng)采用qRT-PCR檢測miR-709水平在肝癌細(xì)胞(HepG2,、SMMC7721、Hep3B和Bel7402)和肝細(xì)胞HL-7702間表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),miR-709在肝癌細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào);(2)MiR-709在肝癌組織中表達(dá)上調(diào):對6對研究的肝癌組織和其癌旁正常組織中的miR-709進(jìn)行初步篩查發(fā)現(xiàn)肝癌組織中miR-709水平上調(diào)表達(dá)。然后對納入的50對肝癌組織及其癌旁正常組織中的miR-709進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),miR-709在肝癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)(P0.001)。在50例肝癌病人中,有40例(80%)肝癌病人的miR-709在肝癌組織中的水平明顯高于其癌旁正常組織。我們研究發(fā)現(xiàn),高表達(dá)的miR-709和肝癌的pTNM分期、侵襲及轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。(2)(1)過表達(dá)miR-709可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖:將miR-709 mimic and inhibitor成功轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞內(nèi),運(yùn)用CCK-8實驗檢測肝癌細(xì)胞增殖發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-709可抑制肝癌細(xì)胞增殖,轉(zhuǎn)染miR-709 mimic可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖;對Ki-67蛋白及其mRNA水平檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-709 mimic可促使細(xì)胞增殖,而轉(zhuǎn)染miR-709 inhibitor則抑制增殖。(2)過表達(dá)miR-709可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲:與轉(zhuǎn)染miR-709 inhibitor肝癌細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染miR-709 mimic過表達(dá)miR-709可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲。(3)GPC5是miR-709作用的靶基因:通過PicTar和TargetScan生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn),miR-709可和GPC5 3'-UTR互補(bǔ)配對。將野生型和突變型GPC5 3,UTR克隆植入熒光素酶報告質(zhì)粒中,分別構(gòu)建野生型(WT)和突變型(Mut)的熒光素酶報告質(zhì)粒并與miR-709 mimic和Scramble轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞中對螢光素酶活性進(jìn)行檢測,以明確miR-709與其靶基因3'UTR間的相互作用。在肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染miR-709 mimic對基因GPC5的野生型3'UTR報告基因質(zhì)粒的螢光素酶的活性有明顯的抑制作用(P0.001);但對基因GPC5的突變型3'UTR報告基因質(zhì)粒的螢光素酶活性沒有明顯的影響。基因GPC5是miR-709的直接作用的靶基因,miR-709能直接與GPC5的3'UTR靶向結(jié)合,發(fā)揮抑制其表達(dá)的作用。轉(zhuǎn)染miR-709 mimic可以明顯抑制HepG2細(xì)胞的GPC5蛋白和mRNA的表達(dá)。將pcDNA質(zhì)粒、pcDNA-GPC5質(zhì)粒、pcDNA-GPC5+miR-709轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞檢測對肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力的影響,轉(zhuǎn)染pcDNA-GPC5質(zhì)粒后的肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力明顯減弱,轉(zhuǎn)染pcDNA-GPC5+miR-709質(zhì)粒后的肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力明顯提高。結(jié)論:MiR-709在肝癌組織中可上調(diào)表達(dá),過表達(dá)的miR-709與肝癌的pTNM分期正相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-709靶向作用GPC5基因可促使肝癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲。
[Abstract]:Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignant tumors in the world. Its incidence and fatality rate are fifth and third of the world's malignant tumors. The onset of liver cancer is hidden, the early diagnosis is difficult, the prognosis is poor and the recurrence is very easy to transfer. This also seriously affects the therapeutic effect of liver cancer. The molecular mechanism of birth development and metastasis is complicated and not completely clear that.MiRNA is a non coding single strand small molecule RNA found in eukaryotic organisms in recent years. MiRNA is highly conserved and plays a major role in the post transcriptional regulatory role in the body. It has been proved that miRNA plays an important role in the development of liver cancer,.MiR-709 is more important. The role of the rich.MiR-709 in liver cancer has not been reported in the organs such as brain, lymph node, heart, heart, lung, liver and kidney. Therefore, the function and mechanism of miR-709 in the development of liver cancer should be studied in depth. Objective: To explore the role of miR-709 in the development of HCC. Methods: using qRT-PCR To detect the miR-709 level of liver cells, hepatoma cells, liver cancer tissues and normal tissues adjacent to cancer, analyze the relationship between miR-709 and the clinicopathological features of liver cancer. MiR-709 mimic and miR-709 inhibitor were transfected into the hepatoma cells to detect the expression of miR-709, and CCK-8 proliferation test, Transwell migration test and Western blot test were used respectively. The changes in the proliferation, cycle, migration and invasion of the hepatocellular carcinoma cell lines. Then by using bioinformatics software to further detect the target gene of miR-709, and then through the luciferase reporter gene detection system, qRT-PCR and Western Blot to verify the target of miR-709. (1) (1) MiR-709 in the hepatoma cells Up-regulated expression: the expression of miR-709 in hepatoma cells (HepG2, SMMC7721, Hep3B and Bel7402) and the expression level of liver cell HL-7702 should be detected by using qRT-PCR to detect the expression of miR-709 in hepatoma cells. (2) MiR-709 is up regulated in the liver cancer tissue: 6 pairs of hepatocellular carcinoma tissues and miR-709 in the normal tissues adjacent to the cancer. The expression of miR-709 in liver cancer tissues was up-regulated by preliminary screening. Then, the expression of miR-709 in the 50 hepatoma tissues and the normal tissues adjacent to the cancer was detected. The expression of miR-709 in the liver cancer tissues was obviously up-regulated (P0.001). Among the 50 cases of liver cancer, 40 cases (80%) of the liver cancer patients had significantly higher levels of miR-709 in the liver cancer tissues. We found that high expression of miR-709 and pTNM staging of HCC, invasion and metastasis are positively correlated. (2) (1) overexpression of miR-709 can promote the proliferation of hepatoma cells: miR-709 mimic and inhibitor is transfected into hepatoma cells successfully, and the proliferation of liver cancer cells is detected by CCK-8 test and the decrease of miR-709 can inhibit the liver The proliferation of cancer cells, transfection of miR-709 mimic can promote the proliferation of hepatoma cells. The detection of Ki-67 protein and its mRNA level showed that transfection of miR-709 mimic could induce cell proliferation, and transfection of miR-709 inhibitor to inhibit proliferation. (2) overexpression of miR-709 can promote the metastasis and invasion of hepatoma cells: transfection m with miR-709 inhibitor hepatoma cells, transfection M IR-709 mimic overexpression of miR-709 can promote the metastasis and invasion of hepatoma cells. (3) GPC5 is the target gene of miR-709 action. Through the prediction of PicTar and TargetScan bioinformatics software, miR-709 can be paired with GPC5 3'-UTR. The wild type and mutant GPC5 3 are cloned into the luciferase reporter plasmid, and the wild type is constructed respectively. The luciferase reporter plasmids of the mutant type (Mut) and the miR-709 mimic and Scramble were transfected into the hepatoma cells to detect the activity of fluoro phosphomase to clarify the interaction between miR-709 and its target gene 3'UTR. In the HepG2 cells of the liver cancer cells, transfection of the luciferase of the wild type 3'UTR reporter gene plasmid of the miR-709 mimic against the gene GPC5. The activity has obvious inhibitory effect (P0.001), but the mutant 3'UTR reporter gene plasmid has no obvious effect on the activity of the fluoro enzyme. Gene GPC5 is the direct target gene of miR-709, and miR-709 can directly bind to the 3'UTR target of GPC5 and play a role in inhibiting its expression. The transfection of miR-709 mimic can obviously inhibit HepG2. The expression of GPC5 protein and mRNA in cells. The effect of pcDNA plasmids, pcDNA-GPC5 plasmids, pcDNA-GPC5+miR-709 transfected HepG2 cells on the proliferation and invasion ability of hepatoma cells, the proliferation and invasion ability of the hepatoma cells transfected with pcDNA-GPC5 plasmids were obviously weakened, and the proliferation and invasion of the hepatoma cells transfected with pcDNA-GPC5+miR-709 plasmids Conclusion: the expression of MiR-709 can be up-regulated in the liver cancer tissues, and the overexpressed miR-709 is positively related to the pTNM staging of liver cancer. Further studies have found that the targeting of miR-709 targeting GPC5 gene can promote the proliferation, metastasis and invasion of hepatoma cells.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：1910687