本文選題：膠質瘤 + HMGA2��； 參考：《山東大學》2015年博士論文

【摘要】：多形性膠質母細胞瘤是成人最常見且惡性程度最高的中樞神經系統腫瘤之一,其發(fā)病率約為3/100,000,在美國每年的確診人數約為23,000人。 WH02007中樞神經系統腫瘤分類標準將其定義為惡性程度最高級別的IV級腫瘤。受發(fā)病部位及其高度侵襲性特點所限,手術治療很難確定腫瘤邊界并全部切除,即使達到肉眼全切并結合術后高強度放射治療和化學治療,膠質母細胞瘤患者的中位生存時間僅有12至15個月。因此,針對多形性膠質母細胞瘤的新治療方案一直是臨床醫(yī)師和腫瘤學家研究的熱點。近年來,隨著對腫瘤細胞的異常高增殖性在膠質母細胞瘤的發(fā)病機制中的重要作用的發(fā)現,基因治療越來越引起大家的關注,并在一系列臨床前實驗中取得了一定進展。然而,目前仍未發(fā)現合適的治療靶點。在調節(jié)細胞增殖的細胞因子中,高遷移率蛋白家族A2(High mobility group A2,HMGA2)被認為是起關鍵作用的因子之一。高遷移率蛋白家族(High mobility group proteins, HMGs)屬于已知成員最多且研究較為完善的非組蛋白質染色體蛋白家族。HMGs具有分子量小、功能強大等特點,因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的高遷移速率而得名。HMGs主要包括HMGA、HMGB和HMGN。HMGA又主要包括HMGA1和HMGA2,其中,HMGA2是目前研究最為廣泛和受關注程度最高的成員。HMGA2可以通過其特有的AT結合區(qū)域與DNA結合并通過改變染色體結構調節(jié)DNA的轉錄。HMGA2在胚胎組織中廣泛表達,在成人體內所有分化成熟的組織,包括心臟、腦組織、肝臟、胰臟、各種血細胞和淋巴細胞中幾乎無表達或僅有微量表達。然而目前發(fā)現HMGA2在多種人類腫瘤尤其是惡性腫瘤中幾乎都有表達,例如甲狀腺癌、直腸癌和乳腺癌等。并且HMGA2與腫瘤的增殖性以后患者的惡性預后密切相關。RNA干擾技術主要包括雙鏈RNA(dsRNA)和短發(fā)夾RNA (ShRNA),是基因工程學自1998年發(fā)現基因沉默現象后興起且日益成熟的基因沉默技術。此項技術的應用可以高效穩(wěn)定特異地抑制目標基因的表達,從而達到針對目的基因理想的沉默效果。目前,RNA干擾技術特別是shRNA已被成功應用于基因功能研究、癌癥等疾病的發(fā)病機理和基因治療等生命科學領域。本研究目的是：首先,檢測HMGA2在成人正常腦組織及各WHO病理分級惡性膠質瘤包括膠質母細胞瘤中的蛋白表達,探討HMGA2與惡性膠質瘤細胞增殖性的相關性以及它們之間的內在聯系,并通過隨訪和生存分析探討HMGA2高表達與膠質母細胞瘤患者預后的相關關系。然后,通過設計在膠質母細胞瘤細胞中穩(wěn)定高效表達的慢病毒介導的靶向HMGA2的ShRNA載體,研究該重組載體對于膠質母細胞瘤細胞HMGA2的干擾效果,并進一步明確干擾前后膠質母細胞瘤細胞的增殖及侵襲能力變化,以及通過動物體內實驗研究HMGA2抑制膠質母細胞瘤生長速率的影響,以期探討HMGA2是否可成為未來進行膠質母細胞瘤基因治療研究的有效靶點。的增殖性以后患者的惡性預后密切相關。RNA干擾技術主要包括雙鏈RNA(dsRNA)和短發(fā)夾RNA (ShRNA),是基因工程學自1998年發(fā)現基因沉默現象后興起且日益成熟的基因沉默技術。此項技術的應用可以高效穩(wěn)定特異地抑制目標基因的表達,從而達到針對目的基因理想的沉默效果。目前,RNA干擾技術特別是shRNA已被成功應用于基因功能研究、癌癥等疾病的發(fā)病機理和基因治療等生命科學領域。本研究目的是：首先,檢測HMGA2在成人正常腦組織及各WHO病理分級惡性膠質瘤包括膠質母細胞瘤中的蛋白表達,探討HMGA2與惡性膠質瘤細胞增殖性的相關性以及它們之間的內在聯系,并通過隨訪和生存分析探討HMGA2高表達與膠質母細胞瘤患者預后的相關關系。然后,通過設計在膠質母細胞瘤細胞中穩(wěn)定高效表達的慢病毒介導的靶向HMGA2的ShRNA載體,研究該重組載體對于膠質母細胞瘤細胞HMGA2的干擾效果,并進一步明確干擾前后膠質母細胞瘤細胞的增殖及侵襲能力變化,以及通過動物體內實驗研究HMGA2抑制膠質母細胞瘤生長速率的影響,以期探討HMGA2是否可成為未來進行膠質母細胞瘤基因治療研究的有效靶點。第一部分HHGA2在惡性膠質瘤中的表達及與生物學行為和預后的關系目 的HMGA2是高遷移率蛋白家族非常獨特的成員,其基因在腫瘤中的表達增加與多種腫瘤細胞的增殖性和患者惡性預后關系密切。本研究目的是檢測HMGA2基因在正常腦組織和惡性膠質瘤中的蛋白表達,并探討HMGA2與惡性膠質瘤增殖性和侵襲性的相關性；HMGA2與MMP-2和MIB標記系數(MIB-LI)之間的聯系以及HMGA2與膠質母細胞瘤患者預后的相關關系。方法1.標本收集2010年10月-2013年5月期間山東省立醫(yī)院神經外科的原發(fā)惡性膠質瘤手術標本78例以及正常腦組織(取自腦內血腫清除術患者)7例,其中女性41例(年齡21-78歲,平均年齡43.3±4.3歲),男性37例(年齡16-83歲,平均年齡44.5±3.5歲)。惡性膠質瘤患者包括星形細胞瘤27例(WHO II級),間變性星形細胞瘤25例(WHO III級),多形性膠質母細胞瘤26例(WHO IV級)。所有病例診斷均由術后的病理證實,并得到山東省立醫(yī)院病理科的診斷。所有患者術前均未接受手術或者放化療,星形細胞瘤患者術后未行放化療,間變性星形細胞瘤和膠質母細胞瘤患者術后均接受放化療。手術標本部分保存于4%多聚甲醛,部分于-80'C保存以提取mRNA和蛋白質。2. 免疫組織化學染色方法采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(S-P)法,在標準實驗流程下操作,檢測HMGA2、MMP-2和Ki-67蛋白在正常腦組織和不同WHO分級惡性膠質瘤中的表達,以及他們之間的相關性。3.結果判定標準根據半定量免疫組織化學法評價HMGA2反應陽性細胞顯色比例和強度。在光學顯微鏡高倍視野(×400)下,每張切片隨機選擇5個視野進行觀察,計數每200個腫瘤細胞中免疫反應陽性的細胞所占百分比。每張病理切片分別有4名實驗者在雙盲的前提下單獨進行評價。對于有分歧的結果,由實驗者在雙頭顯微鏡下重復評價,直至達到一致。HMGA2表達評估：強陽性(+++)：陽性細胞比例大于65%或顯色深(深棕褐色)；中度陽性(++)：陽性細胞比例介于30%至65%之間或染色略深(黃褐色)；弱陽性(+)：陽性細胞比例小于30%或顯色淺(淺黃色)；陰性(-)：無陽性細胞染色。4.測定HMGA2、MMP-2和Ki-67 mRNA水平和蛋白表達量提取組織中總mRNA并進行逆轉錄反應,采用實時熒光定量(qRT-PCR)法檢測7例正常腦組織和29例惡性膠質瘤組織中HMGA2、MMP-2和Ki67等目的基因的mRNA表達情況。提取組織中總蛋白,使用Western blot法檢測HMGA2蛋白表達。5.生存分析將膠質母細胞瘤患者根據免疫組織化學染色結果進行分組：強陽性(+++)和中度陽性(++)為強表達組,弱陽性(+)和陰性(-)為弱表達組。對兩組患者進行隨訪并進行生存分析。6.統計學處理用Fisher精確檢驗分析HMGA2在不同WH0分級惡性膠質瘤中的表達情況。Spearman等級相關分析用于檢驗HMGA2與MMP-2、Ki-67以及患者年齡和性別的關系。Kaplan-Meier法繪制生存曲線,并應用log-rank法進行生存分析。所有統計學處理應用SPSS(19.0版本)統計學軟件進行分析。設定P0.05有統計學意義。結果HMGA2在正常腦組織中無表達,在惡性膠質瘤中可見強弱不等的細胞核著色。HMGA2在膠質瘤組織中總的陽性(率)為92.3%(72/78)。HMGA2與膠質瘤惡性程度存在顯著性差別：在間變性星形細胞瘤(P=,037)和膠質母細胞瘤中(P=.007)的表達高于星形細胞瘤,然而在間變性星形細胞瘤與膠質母細胞瘤間未發(fā)現明顯差別(P-.862)。HMGA2的表達與Ki-67(r=0.415, P.01)和MMP-2(r=0.363,P.01)存在相關性,但是未發(fā)現其與患者年齡(r=-0.073,P=.525)和性別(r=0.415, P.01)存在相關關系。另外,qRT-PCR結果顯示HMGA2 mRNA在間變性星形細胞瘤(1.98倍,P=.029)和膠質母細胞瘤(2.56倍,P.01)中的表達高于星形細胞瘤,然而在膠質母細胞瘤與間變性星形細胞瘤間未發(fā)現明顯差別(1.29倍,P=.118)。 HMGA2 mRNA表達與MMP-2(r=0.432,P=.010)和Ki-67(r=0.386,P.039)之間存在相關關系。Western blot結果顯示HMGA2蛋白在間變性星形細胞瘤(P.01)和膠質母細胞瘤(P.01)中的表達高于星形細胞瘤,在膠質母細胞瘤中的表達也顯著高于間變性星形細胞瘤(P=.028)。在正常腦組織中見微量表達。HMGA2高表達組膠質母細胞瘤患者的預后差于低表達組(P.05)。結論1.HMGA2在正常腦組織中幾乎無表達。2.HMGA2在不同WHO病理級別惡性膠質瘤中的表達有顯著性差異,HMGA2的表達與WHO分級相關,同時HMGA2與MMP-2和Ki-67的表達間的相關性存在統計學意義,提示HMGA2與膠質瘤增殖性和侵襲性存在相關關系,HMGA2免疫組織化學染色有助于不同惡性膠質瘤的診斷。3.在膠質母細胞瘤患者中,HMGA2高表達組患者的生存預后差于低表達組,提示HMGA2表達可以作為多形性膠質母細胞瘤患者的有效臨床預后指標。色有助于不同惡性膠質瘤的診斷。3.在膠質母細胞瘤患者中,HMGA2高表達組患者的生存預后差于低表達組,提示HMGA2表達可以作為多形性膠質母細胞瘤患者的有效臨床預后指標。第二部分設計合成并篩選針對HMGA2有效的ShRNA慢病毒載體目 的設計并合成3組靶向HMGA2基因的ShRNA載體,進行慢病毒包裝和提取,并驗證干擾效率,篩選出其中2組有效的慢病毒載體,為下一步的研究做準備。方法1.設計合成ShRNA載體并進行慢病毒包裝運用公眾網站設計軟件,靶向人類INGA2靶基因序列,設計3組ShRNA載體,并驗證其特異性,分別編號為1#,2#,3#；1組陰性對照空白載體,編號為0#。然后進行測序比對。結果顯示四組載體均被構建成功,測序結果證實無誤。應用工具細胞株(人類胚胎腎細胞株HEK293T)進行慢病毒包裝并離心提取包裝成功的慢病毒顆粒,然后進行病毒滴度測定。2.分別利用ShRNA慢病毒載體1#、2#轉染膠質母細胞瘤細胞株(U251細胞)培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的目的細胞(即U251細胞),轉染前一天將目的細胞分入6一孔培養(yǎng)板培養(yǎng),轉染當天按實驗設計的組別分別利用shRNA載體1#、2#和對照空白載體0#進行膠質母細胞瘤細胞的轉染實驗。3.嘌呤霉素篩選穩(wěn)定的轉染U251細胞株將細胞稀釋到1000個細胞/ml,在0.2μg/ml-5 μg/ml的嘌呤霉素濃度范圍內進行篩選,選擇出在10-14天內使細胞全部死亡的最低嘌呤霉素濃度(1 μg/ml)來進行下一步的篩選試驗。在轉染24小時之后開始加嘌呤霉素(1μg/ml)進行篩選。隨著細胞代謝,嘌呤霉素的濃度和活性會逐漸下降,因此每3-5天更換一次含嘌呤霉素的篩選液。熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況,14天后,即可篩選出穩(wěn)定轉染的細胞株,并后續(xù)置于含嘌呤霉素0.2μg/ml的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。4.驗證沉默目的基因效果,篩選有效慢病毒載體。選出轉染效率為90%左右的組,采用qRT-PCR和western blot的方法檢測HMGA2基因的mRNA和蛋白質表達情況,進而判斷不同靶點的干擾效果,篩選出1組有效載體。結果1.在3組實驗組shRNA載體中,1#、2#、3#轉染效率分別為89.4±6.5%、93.6±5.7%、78.6±12.3%；陰性對照空白載體0#的轉染效率為96.1±5.4%。2.3個靶點均對HMGA2有沉默效果。與陰性對照載體0#對比,實驗載體1#,2#,3#沉默效率分別為78.3%、82.4%、50.6%。綜合轉染效率與沉默效果,1#、2#載體為理想靶點,我們在其中選取了載體1#進行下一步實驗。結論1_本部分實驗成功設計并構建了3組特異性靶向人類HMGA2基因的ShRNA慢病毒載體,病毒滴度較高,可以滿足下一步的實驗要求。2.從3組重組載體中,根據靶向基因的mRNA和蛋白質沉默效率,篩選出2組靶向HMGA2的高效率慢病毒載體,為下一步靶向人膠質母細胞瘤U251細胞株的HMGA2基因進行轉染沉默提供了可靠有效的實驗基礎。HMGA2基因的mRNA和蛋白質表達情況,進而判斷不同靶點的干擾效果,篩選出1組有效載體。結果1.在3組實驗組shRNA載體中,1#、2#、3#轉染效率分別為89.4±6.5%、93.6±5.7%、78.6±12.3%；陰性對照空白載體0#的轉染效率為96.1±5.4%。2.3個靶點均對HMGA2有沉默效果。與陰性對照載體0#對比,實驗載體1#,2#,3#沉默效率分別為78.3%、82.4%、50.6%。綜合轉染效率與沉默效果,1#、2#載體為理想靶點,我們在其中選取了載體1#進行下一步實驗。結論1_本部分實驗成功設計并構建了3組特異性靶向人類HMGA2基因的ShRNA慢病毒載體,病毒滴度較高,可以滿足下一步的實驗要求。2.從3組重組載體中,根據靶向基因的mRNA和蛋白質沉默效率,篩選出2組靶向HMGA2的高效率慢病毒載體,為下一步靶向人膠質母細胞瘤U251細胞株的HMGA2基因進行轉染沉默提供了可靠有效的實驗基礎。第三部分慢病毒介導RNA i沉默HMGA2基因對膠質母細胞瘤細胞增殖及侵襲能力的影響目 的利用構建好的高度特異性和轉染率的攜帶靶向HMGA2 ShRNA的慢病毒載體1#轉染人膠質瘤細胞系U251,并通過嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉染細胞株,研究它們介導RNA干擾對人多形性膠質母細胞瘤細胞株U251增殖和侵襲的影響及其意義。方法1.CCK-8檢測細胞增殖水平培養(yǎng)生長狀態(tài)良好且已穩(wěn)定轉染膠質母細胞瘤細胞(U251細胞)。按實驗設計的分組(空白對照,陰性對照以及陽性)情況,將細胞分入96-孔培養(yǎng)板培養(yǎng)。第2天后每24小時進行一次CCK-8分析,檢測對RNAi靶點有效干擾后的膠質母細胞瘤細胞增殖水平變化。2.小室結合基底膠實驗檢測U251細胞的細胞侵襲培養(yǎng)生長狀態(tài)良好且已穩(wěn)定轉染膠質母細胞瘤細胞(U251細胞)。按實驗設計的分組(空白對照,陰性對照以及陽性)情況,進行鋪matrigel膠的小室實驗分析,檢測對RNAi靶點有效干擾后的膠質母細胞瘤侵襲能力的變化。3.小室實驗檢驗U251細胞株的細胞遷移能力。培養(yǎng)生長狀態(tài)良好且己穩(wěn)定轉染膠質母細胞瘤細胞(U251細胞)。按實驗設計的分組(空白對照,陰性對照以及陽性)情況,進行小室細胞遷移實驗分析,檢測對RNAi靶點有效干擾后的膠質母細胞瘤侵襲能力的變化。4. Western blot檢驗MAPK信號通路關鍵蛋白變化將轉染靶向HMGA2的ShRNA慢病毒載體的穩(wěn)定轉染U251細胞株、轉染陰性載體的U251細胞株和正常對照組U251細胞株進行蛋白質提取,分別利用Western blot實驗檢測Erk、Jnk和p38蛋白質的變化以及磷酸化蛋白質的變化。結果1.CCK-8檢測細胞增殖能力實驗結果表明,實驗組慢病毒載體1#的增殖抑制率(IR)分別為45.2%和40.3%,與陰性對照組和空白對照組相比差異有顯著性(P0.05),這一結果提示在HM6A2被沉默后,膠質母細胞瘤細胞的增殖能力明顯減弱,腫瘤細胞的生長能力明顯被抑制。2.通過小室侵襲方法檢測U251細胞侵襲性,結果顯示兩個慢病毒載體組對照組比較,在沉默HMGA2基因后,膠質母細胞瘤細胞群體中,侵襲能力明顯降低(P0.05)。3.通過小室遷移方法檢測U251細胞侵襲性,結果顯示兩個慢病毒載體組與對照組比較,在沉默HMGA2基因后,膠質母細胞瘤細胞群體中,遷移能力明顯降低(P0.05)。4. Western blot實驗結果顯示,Jnk蛋白質和p38MAPK蛋白質相應的磷酸化蛋白降低,而Erk蛋白的磷酸化蛋白p-Erk蛋白表達升高。結論1. HMGA2基因對于膠質母細胞瘤細胞的生長和增殖能力具有重要作用；特異性沉默HMGA2基因能引起人膠質母細胞瘤細胞生長周期遲緩。2. HMGA2基因對于膠質母細胞瘤細胞的侵襲性和遷移性同樣具有重要作用；特異性沉默HMGA2基因能有效降低人膠質母細胞瘤細胞株U251的侵襲能力和遷移能力。3.Jnk和p38MAPK信號通路可能是HMGA2侵襲性和增殖性相關的關鍵蛋白。4.RNA干擾技術在未來的膠質母細胞瘤基因治療的研究方面具有非常光明的應用價值。HMGA2基因能夠作為膠質母細胞瘤基因治療的有效靶點。移能力。3.Jnk和p38MAPK信號通路可能是HMGA2侵襲性和增殖性相關的關鍵蛋白。4.RNA干擾技術在未來的膠質母細胞瘤基因治療的研究方面具有非常光明的應用價值。HMGA2基因能夠作為膠質母細胞瘤基因治療的有效靶點。第四部分超聲微泡介導的靶向HMGA2基因的RNAi慢病毒載體抑制裸鼠膠質母細胞瘤生長的實驗研究目的裸鼠在體實驗驗證靶向HMGA2基因的慢病毒介導的RNAi對膠質母細胞瘤生長的抑制作用,并探討超聲微泡技術輔助介導基因轉染效率的有效性。方法接種U251細胞于24只BALB/C裸鼠皮下并成瘤后,隨機將其分為4組,每組分別為6只。帶皮下腫瘤模型建瘤成功后,根據實驗目的,三個組別分別為超聲微泡+靶向HMGA2的慢病毒介導的RNAi (MB+ShRNA)組、單純慢病毒組(LV)組、單純超聲微泡(MB)組和空白對照(NC)組。MB+ShRNA組每只裸鼠注射慢病毒載體/微泡混合液400gL(含2.5×1010u慢病毒),MB組每只裸鼠注射陰性病毒載體/微泡400μL,LV組每只裸鼠注射慢病毒載體400 μL, NC組每只裸鼠注射D-Hanks液40091。注射實驗試劑后立即在瘤體表面皮膚涂以超聲耦合劑,并給予超聲輻射,用2.5 MHz超聲波,強度2.0W/cm2,每次30s,間隔30s,共計2次60s照射。每3天用游標卡尺測量皮下腫瘤長徑(a)及短徑(b)變化,腫瘤體積根據公式V=π ab2/6計算。15天后采用頸椎脫位法處死小鼠,取瘤并稱重。結果1.腫瘤的體積、瘤重與抑瘤率(1) MB+ShRNA組、MB+組與NC組動態(tài)觀察至成瘤后第15天,裸鼠皮下種植瘤體積分別為181.7±24.61mm3,303.3±31.44mm3,298.7±26.93mm3。方差分析合并LSD post hoc法兩兩比較MB+ShRNA組與其他兩組有明顯差異(p0.01)。表明IB+ShRNA組裸鼠皮下種植瘤體積較其他兩組有明顯減小。(2)對MB+ShRNA組、MB組與NC組進行動態(tài)觀察至成瘤后第15天,皮下種植瘤重量分別為0.63-0.09g,1.62±0.17g,1.74±0.26g。Tukey法兩兩比較,結果顯示MB+ShRNA組瘤重較其他兩組有明顯差異(p0.01),MB+ShRNA組裸鼠皮下種植瘤與其他兩組相比瘤重明顯減輕。結 論1.本實驗成功構建人膠質母細胞瘤U251皮下種植瘤的裸鼠模型。2.實驗中成功利用超聲聯合微泡液輔助介導了慢病毒載體轉染U251人膠質母細胞瘤的裸鼠皮下種植瘤模型。3.實驗結果驗證了體內環(huán)境下超聲聯合微泡液輔助介導靶向HMGA2的ShRNA慢病毒載體轉染膠質母細胞瘤可以有效抑制腫瘤的生長。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.4

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本文編號：1889374