本文選題：脂質(zhì)體 + 乳腺癌�。� 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：第一部分:抗-αvβ3抗體介導(dǎo)磁性靶向脂質(zhì)體的三步預(yù)定位法在乳腺癌腫瘤新生血管分子靶向成像中的應(yīng)用目的乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤,亦是腫瘤致死的首要原因。鉬靶X線及B超是目前最常用的乳腺癌篩查、診斷工具,但其空間分辨率較差、敏感性較低。MRI被認(rèn)為是目前診斷乳腺癌最為有效的檢查手段,特別是對(duì)于直徑1 cm的病灶;但其應(yīng)用仍受限于特異性較低。本項(xiàng)研究在前期工作的基礎(chǔ)上(超順磁性氧化鐵脂質(zhì)體合成的實(shí)驗(yàn)研究),繼續(xù)深入新型磁性靶向MR對(duì)比劑的合成修飾及成像研究。首先開(kāi)展高空間穩(wěn)定、長(zhǎng)循環(huán)主動(dòng)靶向磁性脂質(zhì)體的制備,分析其理化性質(zhì),評(píng)價(jià)其生物相容性,為MR免疫成像提供特異性靶向?qū)Ρ葎Ｆ浯?通過(guò)建立荷乳腺癌的動(dòng)物模型,利用新型MR對(duì)比劑靶向增強(qiáng)整合素αvβ3受體,評(píng)價(jià)腫瘤新生血管的成像效果,從而實(shí)現(xiàn)早期、準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)乳腺癌病灶。材料與方法1.生物素-PEG修飾的以SPIO為核心結(jié)構(gòu)的新型磁性靶向脂質(zhì)體的制備及其理化特性檢測(cè)1.1新型磁性被動(dòng)及主動(dòng)靶向脂質(zhì)體的制備采用兩步法制備:第一步,分別合成月桂酸穩(wěn)定的SPIO及空白脂質(zhì)體。應(yīng)用化學(xué)共沉淀法制備出月桂酸包裹的SPIO,超聲細(xì)胞粉碎儀作用10 min,轉(zhuǎn)速4000r/min下離心15min,分離出SPIO溶液中較大的顆粒,常溫、避光保存。應(yīng)用薄膜分散法及超聲振蕩法,使DC15:1DSPG:DSPE-PEG2000-生物素(非靶向空白脂質(zhì)體采用DSPE-PEG2000)按摩爾比20:1,總量0.3 mmol自發(fā)形成空白脂質(zhì)體納米顆粒。磷脂中加入0.2mol%的Rho-DHPE進(jìn)行熒光標(biāo)記。第二步,將空白脂質(zhì)體與月桂酸穩(wěn)定的SPIO按一定比例混合,在PH=7.4的緩沖液中透析72h,每8h換液一次,使磷脂雙分子層自發(fā)取代SPIO表面的月桂酸,形成以SPIO為核心結(jié)構(gòu)的被動(dòng)靶向磁性脂質(zhì)體(magnetoliposome,ML)及主動(dòng)靶向磁性脂質(zhì)體(biotinylated magnetoliposome,Bt-ML)。1.2 SPIO及新型磁性靶向脂質(zhì)體的理化性質(zhì)檢測(cè)1.2.1透射電鏡下月桂酸穩(wěn)定的SPIO、空白脂質(zhì)體、ML及Bt-ML的形態(tài)學(xué)觀察及粒徑測(cè)量各取一滴月桂酸穩(wěn)定的SPIO、空白脂質(zhì)體、ML及Bt-ML置于敷有支撐膜的銅網(wǎng)上,靜置約5 min后,用濾紙小片從銅網(wǎng)邊緣吸干多余液體,用1%的磷鎢酸負(fù)染30 s后(SPIO無(wú)需負(fù)染),用濾紙小片從銅網(wǎng)邊緣吸干多余液體,靜置半小時(shí)后置于透射電鏡下觀察。1.2.2月桂酸穩(wěn)定的SPIO、ML及Bt-ML的流體粒徑測(cè)定分別吸取5μl的樣品,去離子水3 ml稀釋至比色皿中,使用Malvern-3000HS激光粒度測(cè)定儀測(cè)定其流體粒徑及分布:所選激光光源的波長(zhǎng)為633.0 nm,散射角為90°,測(cè)試溫度為25 ℃。1.2.3采用原子吸收光譜法測(cè)定月桂酸穩(wěn)定的SPIO、ML及Bt-ML的鐵含量取3ml樣品,使用王水(1 ml 65%HN03+ 2 ml 30%H202)消解樣品中的Fe304,制成待測(cè)試液,于原子吸收光譜儀波長(zhǎng)372.2 nm處測(cè)量其吸光度值。1.2.4 X線粉末衍射晶體結(jié)構(gòu)分析分別取冷凍干燥的SPIO、MIL及Bt-ML研細(xì),置于X線多晶粉末衍射儀中,采用鎳過(guò)濾的CuKα射線,掃描速度為4θmin-1,掃描范圍20為10°至90°。將所得圖譜與國(guó)際粉末衍射標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合會(huì)出版的PDF卡片比較,以此確定樣品的晶體結(jié)構(gòu)。1.2.5磁化率的測(cè)定精密稱(chēng)取冷凍干燥的SPIO、ML及Bt-ML適量,置于MPMSXL-7磁學(xué)性質(zhì)測(cè)量系統(tǒng)中,測(cè)定溫度為300K,磁場(chǎng)強(qiáng)度為-1T至+1T,測(cè)量樣品的磁滯曲線。1.2.6 T2弛豫率的測(cè)定將鐵濃度為 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mmol/L 的 SPIO、ML 及 Bt-ML 溶液分別裝于直徑lcm的試管中,使用MR頭部線圈,掃描序列采用T2mapping,測(cè)量不同濃度各樣品的T2值,擬合1/T2與鐵濃度的線性方程,計(jì)算樣品的T2弛豫率。2.評(píng)價(jià)新型磁性靶向脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性及體內(nèi)外逃逸巨噬細(xì)胞吞噬的特性;2.1巨噬細(xì)胞的體外吞噬實(shí)驗(yàn)將RAW264.7(小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞)接種于培養(yǎng)皿中,37 ℃C,5%C02條件下培養(yǎng)24 h,細(xì)胞達(dá)到80-90%匯合后,以5 × 1 05個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,經(jīng)24 h培養(yǎng)后,分別加入含有SPIO、ML及Bt-ML的1640全培溶液2 ml(鐵含量50 μg/ml)孵育24小時(shí)后,用PBS洗三遍,以不含樣品的1640全培的細(xì)胞作為空白對(duì)照,每孔分別加入4%多聚甲醛溶液2 ml,固定20 min,PBS洗三遍后,每孔加入普魯士藍(lán)染液(含2%亞鐵氰化鉀和2%鹽酸混合液)2 ml作用30 min后,PBS洗三遍,加入核固紅染液作用5 min,PBS洗三遍后,倒置顯微鏡下觀察。2.2家兔藥物體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)取新西蘭大白兔SPF級(jí)6只(均為雌性,體重2.0-2.5kg),隨機(jī)設(shè)為SPIO組(n=2),ML組(n=2),Bt-ML組(n=2);經(jīng)耳緣靜脈分別注射SPIO、ML及Bt-ML溶液100μmol/kg;2小時(shí)后行空氣栓塞法處死動(dòng)物,快速取其肝臟、脾臟、下領(lǐng)淋巴結(jié)、肺臟、腎臟及心臟組織,用4%福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋、切片,行普魯士藍(lán)染色,于正置顯微鏡下觀察組織內(nèi)的鐵分布情況。2.3乳腺癌細(xì)胞整合素αvβ3受體表達(dá)的檢測(cè)2.3.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同乳腺癌細(xì)胞株αvβ3受體的表達(dá)強(qiáng)度將三種常見(jiàn)的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435S、MDA-MB-231及MCF-7制成單細(xì)胞懸液,然后將細(xì)胞放入EP管內(nèi)與熒光FITC-抗體孵育,分別設(shè)立空白對(duì)照,之后將細(xì)胞放入流式細(xì)胞儀內(nèi)進(jìn)行分析。2.3.2細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞αvβ3受體的表達(dá)位置將乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435S接種于細(xì)胞爬片,4%多聚甲醛固定后,加入含0.3M甘氨酸封閉液封閉,再加入抗體與細(xì)胞在濕盒中孵育,4℃過(guò)夜;經(jīng)DAPI復(fù)染后,封固液封固,封片后移至熒光顯微鏡下觀察。2.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(MTT法)以每孔4× 104個(gè)MDA-MB-435S或MCF7細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板,37℃,5%C02條件下培養(yǎng)48 h后,棄去上清液,分別加入含有SPIO、ML及Bt-ML的DMEM全培溶液200μl,鐵濃度分別為200、400、800、1200、1600及2000μM,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。另外,以僅含培養(yǎng)基,不含細(xì)胞的作為調(diào)零孔;以僅含正常培養(yǎng)細(xì)胞的作為正常對(duì)照孔;以只加入上述納米粒的為樣品對(duì)照孔。培養(yǎng)20 h后,棄去上清液,用PBS洗兩遍后,加入濃度為5 mg/ml的MTT,每孔50μl,于37 ℃、5%C02條件下繼續(xù)孵化4 h后,吸取上清液,每孔加入150μl二甲基亞砜,于平板震蕩儀上震蕩10 min,于酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值,比色時(shí),以空白孔調(diào)零。計(jì)算細(xì)胞存活率,公式為:細(xì)胞存活率=(樣品孔OD值-樣品對(duì)照孔OD值)/正常對(duì)照孔OD值。3.荷乳腺癌SCID小鼠MR靶向增強(qiáng)成像實(shí)驗(yàn)及病理學(xué)檢查3.1新型磁性脂質(zhì)體三步預(yù)定位法靶向腫瘤新生血管整合素αvβ3受體的MR增強(qiáng)成像實(shí)驗(yàn)SPF級(jí)4周齡NOD/SCID雌性小鼠10只,體重18-22 g。制成MDA-MB-435S細(xì)胞懸液,以107個(gè)細(xì)胞/0.2 ml接種于小鼠右側(cè)乳腺脂肪墊下,在SPF環(huán)境下飼養(yǎng)6-8周,腫瘤最大直徑至0.8-1.2cm。三步預(yù)定位法成像方案:首先,經(jīng)尾靜脈注射生物素化抗整合素αvβ3單克隆抗體150 μg;36 h后,緩慢腹腔注射1 mg冷親和素,10 min后,腹腔注射0.5 mg冷鏈霉親和素;2 h后,經(jīng)尾靜脈注射含80μmolFe/kg的ML(n=5)或Bt-ML(n=5)。小鼠在麻醉狀態(tài)下(腹腔注射戊巴比妥鈉),分別于注射造影劑前及2 h后行MR掃描。掃描方法:使用鼠專(zhuān)用線圈,采用FSE-T2WI冠狀位掃描。掃描數(shù)據(jù)經(jīng)圖像軟件處理后,比較增強(qiáng)前后腫瘤區(qū)域的像素灰度值,計(jì)算并比較靶向組及非靶向組腫瘤區(qū)域內(nèi)強(qiáng)化像素點(diǎn)的數(shù)量。1.2腫瘤組織病理學(xué)檢查MR掃描結(jié)束后,離頸處死荷瘤小鼠,取腫瘤組織浸泡于4%多聚甲醛固定,4℃固定過(guò)夜。常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片,行HE、普魯士藍(lán)染色及CD31+羅丹明雙熒光免疫組化,并分析比較MR信號(hào)改變區(qū)與αvβ3表達(dá)位置及腫瘤新生血管的關(guān)系。結(jié)果1.SPIO及新型磁性靶向脂質(zhì)體的理化性質(zhì)檢測(cè)1.1透射電鏡下SPIO顯示為類(lèi)圓形、形態(tài)規(guī)則、大小均勻的黑色顆粒,僅有輕度團(tuán)聚現(xiàn)象,平均粒徑約為13.6 nm。新型被動(dòng)、主動(dòng)靶向磁性脂質(zhì)體電鏡下均顯示為以Fe304顆粒為核心,外層由雙層磷脂膜結(jié)構(gòu)包裹的類(lèi)球體,表面平滑光整,大小較均勻,平均粒徑分別約為17.0和17.6 nm。1.2測(cè)定流體粒徑,SPIO數(shù)均粒徑為86.9 nm,多分散系數(shù)0.146;SPIO經(jīng)脂質(zhì)體包裹后,ML及Bt-ML粒徑有所增加,其數(shù)均粒徑分別為129.0 nm和120.0 nm,多分散系數(shù)分別為0.186和0.235,峰形尖而窄,分布較為均一。1.3原子吸收光譜法測(cè)定月桂酸穩(wěn)定的SPIO的鐵含量為22 mg/ml;新型被動(dòng)、主動(dòng)靶向脂質(zhì)體納米微粒溶液的鐵含量分別為0.48和0.50 mg/ml。1.4 X線粉末衍射晶體結(jié)構(gòu)分析月桂酸穩(wěn)定的SPIO、ML和Bt-ML粉末的晶型與標(biāo)準(zhǔn)Fe3O4粉末的晶型一致,說(shuō)明月桂酸修飾及脂質(zhì)體包裹沒(méi)有明顯改變SPIO的晶型。XRD 衍射圖譜在 2θ為 30.1°、35.5°、43.1°、53.4°、57.0°和 62.6°處均出現(xiàn)主要衍射峰,特征吸收峰強(qiáng)度(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(400),其位置與Fe3O4標(biāo)準(zhǔn)圖譜中的位置一致,說(shuō)明合成產(chǎn)物的主要成分為Fe3O4。1.5月桂酸穩(wěn)定的SPIO、ML和Bt-ML的磁滯曲線均為過(guò)原點(diǎn)的單一曲線,即矯頑力非常小:當(dāng)外加磁場(chǎng)為0時(shí),沒(méi)有剩磁;當(dāng)有外加磁場(chǎng)存在時(shí)產(chǎn)生剩磁,說(shuō)明具有超順磁性,其質(zhì)量飽和磁化強(qiáng)度分別為41.2、11.7和8.05 emu/g。1.6隨著月桂酸穩(wěn)定的SPIO、ML、Bt-ML溶液中鐵濃度增加,T2橫向弛豫時(shí)間縮短,造成T2信號(hào)減低,其T2弛豫率分別為0.722×106、0.611×106、0.675×106mol-1·s-1,高于SPIO T2弛豫率需0.062×106mol-1·s-1的最低標(biāo)準(zhǔn)。2.評(píng)價(jià)新型磁性靶向脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性及體內(nèi)外逃逸巨噬細(xì)胞吞噬的特性;2.1巨噬細(xì)胞的體外吞噬實(shí)驗(yàn):未加入含F(xiàn)e溶液的空白對(duì)照組巨噬細(xì)胞幾乎未見(jiàn)任何藍(lán)染;ML及Bt-ML組僅見(jiàn)少量的巨噬細(xì)胞胞漿被染成淺藍(lán)色;對(duì)照組(SPIO組)多數(shù)巨噬細(xì)胞的胞漿被染成深藍(lán)色,體外吞噬實(shí)驗(yàn)證實(shí)SPIO經(jīng)脂質(zhì)體包裹并經(jīng)PEG表面修飾后,可以顯著減少巨噬細(xì)胞的非特異性吞噬。2.2家兔藥物體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn):普魯士藍(lán)染色示ML及Bt-ML組可見(jiàn)肝、脾及淋巴結(jié)內(nèi)少量的藍(lán)色鐵染顆粒,其顏色較淡;心、腎、肺組織內(nèi)則罕見(jiàn)藍(lán)染顆粒;相反,SPIO組(對(duì)照組)內(nèi)可見(jiàn)肝內(nèi)大量藍(lán)染顆粒沉積,其顏色明顯較深,分布于肝Kuppfer細(xì)胞內(nèi),肝細(xì)胞內(nèi)無(wú)藍(lán)染顆粒分布;脾臟內(nèi)也可見(jiàn)到大量藍(lán)染鐵顆粒;淋巴結(jié)、心、腎、肺組織內(nèi)亦罕見(jiàn)藍(lán)染顆粒。由此推斷,ML及Bt-ML可以明顯減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬,延長(zhǎng)其循環(huán)時(shí)間,其結(jié)果與巨噬細(xì)胞的體外吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。2.3乳腺癌細(xì)胞整合素αvβ3受體表達(dá)的檢測(cè):乳腺癌細(xì)胞株αvβ3受體表達(dá)強(qiáng)度依次為 MDA-MB-435SMDA-MB-231MCF-7,因而我們選擇 MDA-MB-435S作為高表達(dá)成瘤細(xì)胞株,MCF-7作為陰性對(duì)照。細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)MDA-MB-435S細(xì)胞αvβ3受體表達(dá)的位置主要位于細(xì)胞膜。2.4細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(MTT法):隨著ML及Bt-ML培養(yǎng)液中鐵濃度升高,MDA-MB-435S及MCF-7細(xì)胞存活率呈輕度下降的趨勢(shì)。但是,ML及Bt-ML的細(xì)胞毒性很低,即使在高濃度(2000 μMFe)下,其細(xì)胞存活率也均在75%以上。3.荷乳腺癌SCID小鼠MR靶向增強(qiáng)成像實(shí)驗(yàn)及病理學(xué)檢查3.1新型磁性脂質(zhì)體三步預(yù)定位法靶向腫瘤新生血管整合素αvβ3受體的MR增強(qiáng)成像實(shí)驗(yàn):靶向組注射Bt-ML后,可見(jiàn)腫瘤區(qū)域出現(xiàn)不均勻的信號(hào)減低,強(qiáng)化的像素點(diǎn)主要分布于腫瘤的周?chē)鷧^(qū)域,約占腫瘤區(qū)域面積的7.0±1.8%。非靶向組注射ML后,可見(jiàn)腫瘤區(qū)域出現(xiàn)較為均勻的輕度信號(hào)減低,其強(qiáng)化程度顯著低于靶向組(t=5.226,P0.05),強(qiáng)化像素點(diǎn)亦主要分布于腫瘤的邊緣區(qū)域,約占腫瘤區(qū)域面積的2.0± 1.1%。3.2腫瘤組織病理學(xué)檢查:熒光免疫組化檢查示靶向組內(nèi)Bt-ML產(chǎn)生的紅色熒光與腫瘤新生血管產(chǎn)生的綠色熒光形態(tài)較為一致,主要分布于腫瘤的周?chē)鷧^(qū)域,少數(shù)分布于中心區(qū)域;而非靶向組內(nèi)ML產(chǎn)生的紅色熒光散在分布于腫瘤新生血管腔外。普魯士藍(lán)染色可見(jiàn)靶向組鐵分布于腫瘤新生血管基本一致,而非靶向組鐵散在分布于腫瘤間質(zhì)內(nèi)。結(jié)論本研究制備出大小均一、性質(zhì)穩(wěn)定,具有超順磁性及低毒性的新型磁性靶向脂質(zhì)體,可以有效減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬,延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間。利用抗體介導(dǎo)的三步預(yù)定位法,通過(guò)生物素-親和素生物信號(hào)放大系統(tǒng),可以主動(dòng)靶向荷瘤乳腺癌新生血管內(nèi)皮的整合素αvβ3受體,提高M(jìn)RI對(duì)微小乳腺癌診斷的特異性及敏感性。第二部分:基于IVIM的MR擴(kuò)散加權(quán)成像在肺部侵襲性真菌感染療效預(yù)測(cè)中的應(yīng)用目的探討基于體素內(nèi)不相干運(yùn)動(dòng)(IVIM)DWMRI技術(shù)在預(yù)測(cè)肺部侵襲性真菌感染(IFI)抗真菌治療療效中的應(yīng)用。材料與方法本研究經(jīng)過(guò)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有受試者均書(shū)面簽署知情同意書(shū)。選擇根據(jù)EORTC/MSG診斷標(biāo)準(zhǔn)懷疑為肺部IFI的患者46例,平均年齡33.9± 13.0歲。所有患者均行3.0 TMR常規(guī)序列及多b值DWI掃描,選擇11個(gè)b值(0-1000 sec/mm2)。使用雙指數(shù)模型計(jì)算假性擴(kuò)散系數(shù)D*、灌注分?jǐn)?shù)f、真性擴(kuò)散系數(shù)D,使用單指數(shù)模型計(jì)算表觀擴(kuò)散系數(shù)(ADCtotal)。使用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(ICC)計(jì)算觀察者間測(cè)量一致性。根據(jù)抗真菌感染療效將患者分為療效較好組(FR組,n=32)和療效較差組(UR組,n=14)。兩組間IVIM參數(shù)值D值、D*值及f值的比較采用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(yàn)法,ADCtotal值的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法。使用ROC曲線評(píng)估IVIM所得參數(shù)對(duì)療效的預(yù)測(cè)效能。結(jié)果FR組的DWI信號(hào)強(qiáng)度衰減曲線符合雙指數(shù)模型,而UR組信號(hào)衰減曲線較符合單指數(shù)模型。所有患者的D值均低于ADCtotal。兩名觀察者間測(cè)量一致性很好(ICC 0.954-0.988,P0.001)。UR組(12.6%± 4.4%)的f值顯著低于FR組(30.2%±8.6%),兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=4.989,P0.001)。但兩組間ADCtotal、D和D*的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。根據(jù)ROC曲線分析表明,f植的閾值為18.6%時(shí)(AUC=0.967),預(yù)測(cè)效能最佳,敏感度和特異度分別為93.8%和92.9%。結(jié)論IVIM-MRI成像技術(shù)可以對(duì)肺部IFI的抗真菌治療療效進(jìn)行預(yù)測(cè),灌注分?jǐn)?shù)f低于18.6%可能是早期預(yù)測(cè)療效較差的影像學(xué)指標(biāo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R737.9;R445.2

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5 王s，

本文編號(hào)：1868228