本文選題：急性紅白血病 + 核型異常��； 參考：《蘇州大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：一、急性紅白血病的臨床和實(shí)驗(yàn)室特征的研究目的 系統(tǒng)分析自2003年至2014年在本院診治的160例急性紅白血病(AEL)患者的臨床及實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn),對(duì)比國(guó)內(nèi)外報(bào)道,揭示本中心AEL患者的特點(diǎn),并補(bǔ)充完善國(guó)際急性紅白血病在細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物方面的研究。方法 1.回顧性分析160例AEL的臨床及實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn),其中143例AEL、40例MDS-E、46例MDS患者的骨髓細(xì)胞均采用直接或短期培養(yǎng)法制備染色體,用熱變性R顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析并分別按照IPSS和UKMRC標(biāo)準(zhǔn)對(duì)這些病例進(jìn)行危險(xiǎn)度分層;其中158例AEL患者按照2008 WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)重新分型,并對(duì)入組的病例進(jìn)行隨訪,按核型特點(diǎn)等分組進(jìn)行生存分析。2.隨機(jī)選取有初診、緩解期DNA樣本的6對(duì)AEL患者進(jìn)行全外顯子測(cè)序,60例初診AEL的DNA樣本進(jìn)行Ion torrent檢測(cè),結(jié)合PCR擴(kuò)增、桑格測(cè)序測(cè)序法共同檢測(cè)驗(yàn)證基因突變,并隨機(jī)選取7例初診AEL的RNA樣本進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片檢測(cè),分析總結(jié)AEL患者分子生物學(xué)特征。結(jié)果 1.按照2001版WHO分型標(biāo)準(zhǔn),160例AEL患者中M6a 148例(占92.5%),M6b 12例(占7.5%)。男性92例,女性68例,男/女比例為1.35:1,中位發(fā)病年齡50歲(13-83歲),白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell count,WBC)中位值為2.7×109/ml(0.52-182×109/ml),血紅蛋白(hemoglobin,Hb)中位值為74g/L(36-148g/L),血小板(platelet,PLT)計(jì)數(shù)中位值為37×109/ml(4-715×109/ml),骨髓紅系前體細(xì)胞百分比中位值60%(50%-97.5%),骨髓原始細(xì)胞占有核細(xì)胞比例中位值16%(0.5%-43.5%),骨髓原始細(xì)胞占非紅細(xì)胞百分比中位值40%(20%-93.5%)。M6a和M6b兩種亞型臨床表現(xiàn)及外周血象相似,均可累及三系,僅骨髓中紅系比例不同。160例AEL病例中共有143例可以進(jìn)行核型分析。正常核型86例,占60.1%,異常核型57例,占39.9%,其中復(fù)雜核型(累及3條及3條以上染色體的異常核型)28例,占AEL的19.6%,占異常核型的49.1%。M6a和M6b兩者的核型分布亦相似,均以正常核型為主,該點(diǎn)與國(guó)外報(bào)道不一致,可能與人種和地域性差異有關(guān)。2.158例AEL按照2008 WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)重新分型,N-AEL 108例,AML-MRC 13例,MDS-AEL 37例。為進(jìn)行同期比較,另有40例骨髓紅系前體細(xì)胞≥50%的骨髓異常綜合征(MDS-E)、46例骨髓紅系前體細(xì)胞50%的骨髓異常綜合征患者(MDS)也入組研究,比較各組間的臨床及實(shí)驗(yàn)室特征。各組發(fā)病性別分布均為男性多于女性,血細(xì)胞降低可累及三系,N-AEL、AML-MRC、MDS-AEL、MDS發(fā)病年齡較MDS-E年輕,N-AEL外周血象僅血小板較MDS-E低,且P0.05,其他各組間外周血象無(wú)明顯差異。N-AEL和MDS-E均以正常核型為主,AML-MRC、MDS-AEL及MDS則以異常核型為主,N-AEL與MDS-AEL間、MDS-E與MDS間核型分布有顯著性差異。3.6對(duì)AEL病例初診、緩解期樣本分別進(jìn)行全外顯子測(cè)序,發(fā)現(xiàn)多種再現(xiàn)性基因突變,其中GATA2突變2處(33.3%)、CEBPA突變4處(66.7%),為進(jìn)一步了解AEL突變情況,本研究對(duì)41例AEL患者進(jìn)行Ion torrent方法檢測(cè)AML常見(jiàn)的突變基因,69例AEL患者進(jìn)行PCR擴(kuò)增及桑格測(cè)序法檢測(cè)GATA2和CEBPA突變,最終發(fā)現(xiàn)GATA2突變13例(18.8%),CEBPA突變33例(47.8%),RUNX1突變(4.9%)、NPM1突變(2.4%)、TET2突變(4.9%)、U2AF1突變(9.8%)、SETBP1(14.6%)等。4.結(jié)合患者臨床信息、核型特征、突變信息,對(duì)AEL患者進(jìn)行不同的分組,比較其預(yù)后差異。71例AEL患者按不同的治療方式分為造血干細(xì)胞移植組和常規(guī)化療組,造血干細(xì)胞移植組預(yù)后明顯優(yōu)于常規(guī)化療組(P0.05)。根據(jù)核型分組,正常核型組中位生存期長(zhǎng)于非復(fù)雜核型組,非復(fù)雜核型組預(yù)后優(yōu)于復(fù)雜核型組,三者之間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。按照IPSS分組,中危組預(yù)后較高危組預(yù)后好,低危組預(yù)后較中危組預(yù)后好,且三組間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。將MDS-E、AML-MRC、N-AEL、MDS-AEL及MDS五組預(yù)后進(jìn)行比較,MDS預(yù)后較前四者好,其總生存期明顯長(zhǎng)于MDS-E、AML-MRC、N-AEL及MDS-AEL,P0.05。根據(jù)突變類(lèi)型對(duì)AML進(jìn)行分組,本研究中CEBPA突變及GATA2突變對(duì)患者預(yù)后均未見(jiàn)明顯影響。5.7例AEL患者表達(dá)譜數(shù)據(jù)與網(wǎng)絡(luò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中5例正常人CD34+細(xì)胞芯片數(shù)據(jù)及10例None-AEL數(shù)據(jù)分別進(jìn)行比較分析,AEL表達(dá)譜與正常CD34+細(xì)胞的表達(dá)譜及None-AEL病例表達(dá)譜明顯不同。結(jié)論:1.本組AEL病例與西方AEL患者臨床特點(diǎn)相似,但本組病例有不同的細(xì)胞遺傳學(xué)特點(diǎn),本研究AEL人群核型分布以正常核型為主,且核型風(fēng)險(xiǎn)的升高與預(yù)后不良密切相關(guān)。2.本組AEL病例有獨(dú)特的分子生物學(xué)特征。GATA2和CEBPA突變?cè)贏EL人群中頻發(fā),其他AML常見(jiàn)基因突變?cè)贏EL中散在分布。3.本組AEL病例具有獨(dú)特的基因表達(dá)譜。二、GATA2相關(guān)基因的克隆、真核表達(dá)載體的構(gòu)建及功能研究目的 1.克隆并構(gòu)建GATA2突變體P304H、L321P、R330X及GATA2野生型真核表達(dá)載體。2.對(duì)GATA2各突變體進(jìn)行初步的功能研究,以探索急性紅白血病的發(fā)病機(jī)制。方法 1.通過(guò)定點(diǎn)誘變的方法,以PFLAG-GATA2質(zhì)粒為模板,采用GATA2基因定點(diǎn)誘變特異性引物分別誘變出PFLAG-GATA2-P304H、PFLAG-GATA2-L321P、PFLAG-GATA2-R330X質(zhì)粒;繼而以這些質(zhì)粒為模板,擴(kuò)增出GATA2各突變體及野生型的基因編碼區(qū),并與慢病毒載體LV5連接,構(gòu)建攜帶GATA2各相關(guān)基因的真核表達(dá)載體。所構(gòu)建的全部克隆均送測(cè)序鑒定。2.慢病毒包裝并侵染32D及NIH3T3細(xì)胞系,構(gòu)建攜帶GATA2各突變體及野生型的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,western blot驗(yàn)證目的蛋白的表達(dá)。3.采用免疫熒光的方法觀察NIH3T3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中野生型GATA2及其各突變體在細(xì)胞中的亞定位。4.以32D穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株為研究對(duì)象,繪制生長(zhǎng)曲線、集落培養(yǎng),明確GATA2突變對(duì)細(xì)胞增殖的影響。5.對(duì)32D各穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株進(jìn)行瑞氏染色及TMB聯(lián)苯胺染色,并以Ter119流式抗體檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志變化,RQ-PCR方法檢測(cè)紅系分化相關(guān)分子β-globin、βh1-globin的表達(dá)水平。6.以293T為細(xì)胞模型,采用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)的方法,檢測(cè)GATA2各突變體轉(zhuǎn)錄活性的變化。7.抽提32D-GATA2-vector、32D-GATA2-P304H、32D-GATA2-L321P、32D-GATA2-R330X、32D-GATA2-wt的RNA樣本,并進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片檢測(cè),比較GATA2突變和野生型及空載體組的差異,探索GATA2突變?cè)诩毙约t白血病發(fā)病中的作用。結(jié)果 1.免疫熒光結(jié)果顯示GATA2蛋白野生型定位于細(xì)胞核;P304H、L321P及野生型GATA2蛋白亞細(xì)胞定位均位于細(xì)胞核,GATA2-R330X目的蛋白胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與胞核內(nèi)均有高表達(dá)。2.穩(wěn)定表達(dá)GATA2各突變體及野生型的32D細(xì)胞,各組間增殖速度無(wú)明顯差異。攜帶GATA2各突變體及野生型的32D細(xì)胞均能在軟瓊脂上呈克隆性生長(zhǎng),但各組間集落形成能力亦無(wú)明顯差異。3.攜帶GATA2各突變體及野生型的32D細(xì)胞進(jìn)行瑞氏染色,各組間形態(tài)上差異不明顯,但聯(lián)苯胺染色結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)GATA2各突變體可使聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增加,以R330X最為明顯。4.32D各突變體穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株細(xì)胞的Ter119表達(dá)增加,且與空載體組有顯著性差異。5.32D各突變體穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的β-globin、βh1-globin的表達(dá)水平均曾上升趨勢(shì)。6.GATA2各突變體的轉(zhuǎn)錄活性較GATA2野生型明顯降低,且當(dāng)各突變體與一定劑量的GATA2野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí),R330X組轉(zhuǎn)錄活性仍低于野生型組,且P0.05。7.GATA2各突變體的表達(dá)譜與GATA2野生型組不同,GATA2突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞表達(dá)譜的改變。結(jié)論 1.GATA2突變可促進(jìn)細(xì)胞向紅系分化,并導(dǎo)致32D細(xì)胞表達(dá)譜改變。2.R330X可導(dǎo)致GATA2蛋白亞細(xì)胞定位改變。
[Abstract]:The clinical and laboratory characteristics of the patients with acute erythroleukemia were analyzed by direct or short - term culture method . The results showed that there were no significant differences between the two groups . The results showed that there were 13 cases of abnormal karyotype ( 47.8 % ) , 33 cases ( 47.8 % ) of patients with acute myeloid leukemia ( AML - MRC ) , 13 cases of AML - MRC and 37 cases of MDS . The expression profiles of GATA2 and the wild type of GATA2 were studied . The results showed that the expression profiles of GATA2 and CEBPA were similar to those of normal CD34 + cells . 3 . The expression profiles of GATA2 mutants and wild type GATA2 were significantly lower than those in wild type group .

【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R733.71

【參考文獻(xiàn)】

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1 何軍,陳子興,薛永權(quán),李建琴,何海龍,黃益萍,何亞香,柴憶歡,朱伶俐;兒童急性淋巴細(xì)胞白血病染色體結(jié)構(gòu)異常的融合基因檢測(cè)[J];中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志;2005年05期

2 柴憶歡;呂慧;李建琴;盧俊;肖佩芳;何亞香;邵雪軍;;兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病124例遺傳學(xué)異常分析[J];中華兒科雜志;2007年09期

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本文編號(hào)：1836432