本文選題：RNA結(jié)合蛋白 + RNPC1　； 參考：《南京醫(yī)科大學》2016年碩士論文

【摘要】：目的：研究乳腺癌中RNA結(jié)合蛋白RNPC1通過調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性進而調(diào)節(jié)PR的具體機制,并研究RNPC1對于PR功能的影響。材料與方法：在乳腺癌組織中運用免疫組化方法檢測RNPC1和PR的表達情況,并在乳腺癌細胞中用免疫熒光檢測RNPC1和PR的表達定位。通過慢病毒轉(zhuǎn)染,在乳腺癌細胞株MCF7, BT474, SUM1315, MDA-MB-231中構(gòu)建RNPC1和PR的過表達及干擾的細胞模型。實時熒光定量PCR (qRT-PCR)及Western-blot分別用來檢測相關(guān)PR及其下游靶基因mRNA和蛋白的表達水平。同時鑒于ER對于PR也有調(diào)節(jié)作用,首先通過轉(zhuǎn)染ER干擾慢病毒,進行ER敲除,進而進行RNPC1過表達及干擾細胞系構(gòu)建,并檢測PR的mRNA和蛋白的表達水平。放線菌素D用以處理RNPC1(RNPC1)過表達及其對照(NC)細胞株,RNPC1干擾(shRNPC1)及其相應(yīng)對照(SCR)細胞株,并分別于不同時間點用qRT-PCR檢測PR的mRNA水平。RNA免疫共沉淀(RIP)用以驗證RNPC1蛋白與PR mRNA的結(jié)合反應(yīng)。RNA電泳遷移率(REMSA)實驗用以檢測RNPC1蛋白與PR具體結(jié)合位點。雙熒光素酶實驗用以進一步證實RNPC1蛋白與PR結(jié)合的位點并驗證其功能。CCK8和平板克隆實驗用以檢測RNPC1過表達及敲除后的細胞株對孕激素處理的功能變化。通過RNPC1及ER的雙敲除細胞株中PR的檢測以確定ER在RNPC1調(diào)節(jié)PR過程中的作用。通過在NOD-SCID小鼠體內(nèi)構(gòu)建人源性乳腺移植模型,提高乳腺癌細胞成瘤效率,并通過皮下包埋孕激素緩釋片檢測過表達RNPC1對于孕激素處理的體內(nèi)成瘤效果的影響。結(jié)果：在乳腺癌組織中RNPC1與PR表達具有正相關(guān)性(P0.05)。RNPC1在乳腺癌細胞中的定位是在細胞核及細胞質(zhì)中,PR主要定位于細胞核。乳腺癌細胞MCF-7級BT474細胞中,過表達RNPC1, PR表達上調(diào),敲除RNPC1, PR表達降低,同時檢測PR下游靶基因Wnt4和β-catemin均受到RNPC1調(diào)節(jié)。而在敲除ER的細胞系中,RNPC1對于PR仍有調(diào)節(jié)作用,說明RNPC1對于PR的調(diào)節(jié)是獨立的過程。過表達RNPC1后,PR的mRNA穩(wěn)定性增強,而敲除RNPC1則降低PR的mRNA穩(wěn)定性。RNPC1可以和PR的3’非翻譯區(qū)的AU-富含元件結(jié)合進而增強其穩(wěn)定性。功能實驗也表明,RNPC1可以增強通過PR而發(fā)揮促進增殖作用的孕激素的功能。結(jié)論：乳腺癌中RNPC1與PR具有相關(guān)性,過表達RNPC1可以促進PR表達,干擾RNPC1降低PR表達。RNPC1可以和PR的mRNA 3'非翻譯區(qū)結(jié)合,增強mRNA穩(wěn)定性。RNPC1可以增強通過PR發(fā)揮作用的孕激素的促增殖作用。
[Abstract]:Aim: to study the mechanism of RNA binding protein RNPC1 regulating PR by regulating the stability of mRNA in breast cancer and the effect of RNPC1 on PR function. Materials and methods: immunohistochemical method was used to detect the expression of RNPC1 and PR in breast cancer, and immunofluorescence was used to detect the expression of RNPC1 and PR in breast cancer cells. The overexpression and interference of RNPC1 and PR in breast cancer cell lines MCF7, BT474, SUM1315, MDA-MB-231 were established by lentivirus transfection. Real-time quantitative PCR qRT-PCR and Western-blot were used to detect the expression level of mRNA and protein in PR and its downstream target genes, respectively. At the same time, ER can also regulate PR. Firstly, ER interferes with lentivirus, carries out ER knockout, then overexpresses RNPC1 and interferes cell line construction, and detects the expression level of mRNA and protein of PR. Actinomycin D was used to treat the overexpression of RNPC1 / RNPC1 and its control cell line (RNPC1), which interfered with shRNPC1) and its corresponding control cell line (SCR). At different time points, qRT-PCR was used to detect the mRNA level of PR. The RIPs were used to verify the binding reaction between RNPC1 protein and PR mRNA. The RMSAs were used to detect the specific binding sites of RNPC1 protein to PR. Double luciferase assay was used to further confirm the binding site of RNPC1 protein to PR, and to verify its function. CCK8 and plate cloning assay were used to detect the changes of progesterone treatment in RNPC1 overexpression and knockout cell lines. The role of ER in the regulation of PR by RNPC1 was determined by the detection of PR in RNPC1 and ER double knockout cell lines. Human mammary gland transplantation model was established in NOD-SCID mice to improve the tumorigenic efficiency of breast cancer cells. The effect of overexpression of RNPC1 on the tumorigenesis of breast cancer cells treated with progesterone was detected by subcutaneous embedding of progesterone sustained-release tablets. Results: there was a positive correlation between the expression of RNPC1 and PR in breast cancer cells. The localization of RNPC1 in breast cancer cells was mainly located in the nucleus and cytoplasm. Overexpression of RNPC1, up-regulation of PR expression, down-regulation of knockout RNPC1 and decrease of PR expression were observed in BT474 cells of MCF-7 grade. Wnt4 and 尾 -catemin, the downstream target genes of PR, were all regulated by RNPC1. However, RNPC1 still regulates PR in the cell line that knockout ER, indicating that the regulation of PR by RNPC1 is an independent process. The mRNA stability of PR was enhanced after overexpression of RNPC1, while knockout RNPC1 decreased the mRNA stability of PR. RNPC1 could bind to AU-rich elements in 3'untranslated region of PR and enhance its stability. Functional experiments also showed that RNPC1 could enhance the progesterone function which promoted proliferation through PR. Conclusion: there is a correlation between RNPC1 and PR in breast cancer. Overexpression of RNPC1 can promote the expression of PR and interfere with the decrease of PR expression. RNPC1 can bind to the mRNA 3 'untranslated region of PR. Enhancing the stability of mRNA. RNPC1 could enhance the proliferation of progesterone acting through PR.
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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