發(fā)布時間：2018-04-24 14:57

  本文選題：視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 + miR-125a-5p　； 參考：《南京大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Retinoblastoma,RB)是在嬰幼兒中發(fā)生的最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤,其侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng),嚴(yán)重危害著患者的生命以及視力。雖然目前的臨床治療水平逐漸提高,治療目標(biāo)也從拯救患兒生命到保存視力提高患兒生活質(zhì)量,但部分患者就診時已處于晚期,腫瘤已經(jīng)向其他部位侵襲,治療效果差。所以,實(shí)現(xiàn)挽救患者視力這樣的治療目標(biāo)關(guān)鍵在于早期診斷。miRNA是一類短小序列的內(nèi)源性非編碼RNA,長度約為21-25個核苷酸,其通過影響互補(bǔ)mRNA的翻譯和穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)發(fā)揮作用。在這一領(lǐng)域,越來越多的證據(jù)表明,miRNA可以通過下調(diào)致癌靶標(biāo)或通過負(fù)調(diào)節(jié)抑癌基因蛋白的腫瘤啟動子起到腫瘤抑制劑類似的作用。研究表明miR-125a-5p在多種人類腫瘤中表達(dá)異常,并發(fā)揮著抑制癌癥的作用,抑制多種人類癌癥的生長和轉(zhuǎn)移,包括卵巢癌,肝細(xì)胞癌和乳腺癌。但miR-125a-5p在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中發(fā)揮的作用尚不清楚。1.研究材料和方法1.1臨床樣本的收集和細(xì)胞培養(yǎng)在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患兒進(jìn)行眼球摘除手術(shù)過程中收集視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織及其配對的非腫瘤視網(wǎng)膜組織。標(biāo)本收集后一部分迅速保存于液氮中,另一部份標(biāo)本進(jìn)行病理檢查。購買視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Y79細(xì)胞和WERI-Rb-1細(xì)胞。1.2視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中異常表達(dá)miRNAs篩選及目標(biāo)miRNA的選擇與驗證采用生物芯片初步篩選在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)水平顯著改變的miRNAs,再使用實(shí)時定量PCR技術(shù)在臨床視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中對其中改變最為明顯的miR-125a-5p進(jìn)行表達(dá)驗證。利用miR-125a-5p表達(dá)水平來區(qū)分視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織和正常視網(wǎng)膜組織。探索miR-125a-5p的表達(dá)水平與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤病理特征的相關(guān)性。1.3 miR-125a-5p對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響通過轉(zhuǎn)染使miR-125a-5p在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤表達(dá)水平增加,利用各種分子細(xì)胞生物學(xué)和顯微成像技術(shù),觀察視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖(細(xì)胞計數(shù)法、MTT法)、遷移(Transwell法)和侵襲(Matrigel侵襲實(shí)驗)等細(xì)胞行為學(xué)的變化。1.4建立軟瓊脂克隆形成實(shí)驗和裸鼠視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤模型,研究miR-125a-5p對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤生長情況的影響軟瓊脂克隆形成實(shí)驗檢測miR-125a-5p的表達(dá)水平對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤生長發(fā)展情況的影響。建立裸鼠皮下成瘤模型,裸鼠皮下注射視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞,監(jiān)測瘤體及小鼠生長情況。皮下注射1-2周后肉眼可見瘤體時,頸椎脫臼處死裸鼠,測量瘤體大小,使用公式V=LW2/2計算出腫瘤體積,繪制生長曲線。1.5 miR-125a-5p下游靶點(diǎn)TAZ的驗證應(yīng)用TargetScan、MiRanda和PicTar預(yù)測軟件,分析相關(guān)因素,采用miRWalk數(shù)據(jù)庫篩選出TAZ具有作為miR-125a-5p下游靶點(diǎn)的可能性。隨后利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-125a-5p對靶TAZ的負(fù)調(diào)控作用,在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中過表達(dá)miR-125a-5p后使用蛋白印跡實(shí)驗檢測下游標(biāo)靶TAZ的蛋白水平。分析視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤手術(shù)取得組織中TAZ的蛋白水平,并對其和miR-125a-5p的表達(dá)水平作相關(guān)性分析。1.6 miR-125a-5p下游直接靶點(diǎn)TAZ對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的生物學(xué)功能的研究利用RNAi技術(shù)敲低視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中TAZ的表達(dá)水平,利用各種分子細(xì)胞生物學(xué)和顯微成像技術(shù),觀察視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖(細(xì)胞計數(shù)法、MTT法)、遷移(Transwell法)和侵襲(Matrigel侵襲實(shí)驗)等生物學(xué)行為的變化,再通過在已經(jīng)過表達(dá)miR-125a-5p的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞中過表達(dá)TAZ探究逆轉(zhuǎn)miR-125a-5p的抑制作用能夠被逆轉(zhuǎn)。2.主要研究結(jié)果2.1 miR-125a-5p在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Y79細(xì)胞和WERI-Rb-1細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯下調(diào),miR-125a-5p的表達(dá)水平對于區(qū)分視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織和視網(wǎng)膜非腫瘤組織具有顯著差異。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示miR-125a-5p的表達(dá)水平與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的TNM分期存在顯著相關(guān)性。2.2外源性過表達(dá)miR-125a-5p能顯著抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及瘤體的生長。2.3 TAZ是miR-125a-5p的直接下游靶點(diǎn)。TAZ在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織和細(xì)胞株中表達(dá)較配對的非腫瘤視網(wǎng)膜組織增高。過表達(dá)miR-125a-5p能明顯降低TAZ的表達(dá)水平。MiR-125a-5p和TAZ在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性。2.4敲低TAZ的表達(dá)水平能夠抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的能力,與過表達(dá)miR-125a-5p作用相似。并且,在過表達(dá)miR-125a-5p的基礎(chǔ)上再過表達(dá)TAZ能部分或完全逆轉(zhuǎn)miR-125a-5p對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和瘤體生長的抑制作用。3.結(jié)論3.1 miR-125a-5p在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)水平明顯下調(diào),并與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤TNM分期呈負(fù)相關(guān),提示miR-125a-5p可能在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮類似抑癌基因的作用。3.2過表達(dá)miR-125a-5p或敲低TAZ的表達(dá)水平均能明顯抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,miR-125a-5p過表達(dá)對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤產(chǎn)生的抑制作用能被其下游直接靶點(diǎn)TAZ逆轉(zhuǎn),提示miR-125a-5p可能通過調(diào)控TAZ的表達(dá)來參與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展過程。3.3用miR-125a-5p的表達(dá)水平能顯著區(qū)分視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織和非視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織。同時,miR-125a-5p及其下游直接靶點(diǎn)TAZ在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的表達(dá)水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性,提示miR-125a-5p和TAZ均有可能成為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤診斷或治療的新靶點(diǎn)。
[Abstract]:In this field , the expression of miR - 125a - 5p can be regulated by down - regulation of the expression level of miR - 125a - 5p and the expression level of miR - 125a - 5p . Conclusion : The expression level of miR - 125a - 5p and miR - 125a - 5p can significantly decrease the proliferation , migration , invasion and tumor growth .

【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R739.7

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本文編號：1797117