本文選題：BDE-209 + TR　； 參考：《山東大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：濾泡上皮細(xì)胞起源的甲狀腺癌(TC)是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤,城市女性第五位常見(jiàn)惡性腫瘤,近40年來(lái)呈明顯增長(zhǎng)趨勢(shì),其中以甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroidcarcinoma,PTC)最常見(jiàn)。PTC的發(fā)生與碘過(guò)量、甲狀腺激素(thyroid hormone,TH)內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡等有關(guān)。經(jīng)典型PTC五年生存率高達(dá)95%,但高危亞型PTC以及甲狀腺濾泡癌、低分化癌、未分化癌,具有較高復(fù)發(fā)率和死亡率。該類(lèi)病變多伴有BRAFV600E基因突變,預(yù)后相對(duì)較差,術(shù)后激素抑制和I131治療效果較差而容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此,新型PTC致癌基因和信號(hào)通路的鑒定和機(jī)制研究將為制定更加完善的個(gè)體化治療方案提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。十溴聯(lián)苯醚(Decabromodi-phenyl ether,BDE-209)是一種溴化的阻燃劑,被稱(chēng)為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EEDs)廣泛應(yīng)用于家用電器、家具、紡織品中,由于PBDEs不與基質(zhì)材料形成化學(xué)鍵,容易從產(chǎn)品中逸出而進(jìn)入環(huán)境。BDE-209結(jié)構(gòu)與三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine,T3)和甲狀腺素(thyroxine,T4)及多氯聯(lián)苯醚(polychlorinated biphenyls,PCBs)非常相似(圖1)。有報(bào)道稱(chēng)雌激素代謝異常與甲狀腺乳頭狀癌(PTC)發(fā)病相關(guān),而研究表明,BDE-209無(wú)擬雌激素和抗雌激素活性。研究表明BDE-209可分解為小分子化合物,并且在哺乳動(dòng)物體內(nèi)具有毒性持久性,生物累積效應(yīng),內(nèi)分泌毒性甚至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的致癌性。BDE-209可能作為一種TH類(lèi)似物,通過(guò)作用于甲狀腺激素受體(thyroxine receptor,TR)干擾TH的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。國(guó)內(nèi)也有研究推斷BDE-209可能干擾TH轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的兩個(gè)重要蛋白TBG和TH轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合蛋白TTR,從而影響結(jié)合態(tài)T3的分離、FT4的脫碘過(guò)程,使血清T4降低并通過(guò)負(fù)反饋?zhàn)饔脤?dǎo)致TSH升高。本課題擬在利用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)和臨床標(biāo)本的檢測(cè),篩選出BDE-209誘導(dǎo)甲狀腺腫瘤發(fā)生的靶基因,深入探討B(tài)DE-209調(diào)控TR信號(hào)通路的分子生物學(xué)機(jī)制及其在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn),BDE-209顯著促進(jìn)人正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞、甲狀腺癌細(xì)胞的增殖和遷移,并伴有甲狀腺激素受體TR的降低;移植瘤動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)顯示,BDE-209可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn);3例甲狀腺疾病患者和一例正常人血液中均檢測(cè)出BDE-209,其中PTC病例BDE-209濃度最高,而TR偏低;因而,我們推測(cè)BDE-209可能通過(guò)調(diào)節(jié)TR、促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移等參與甲狀腺癌的發(fā)生與進(jìn)展。本研究擬通過(guò)細(xì)胞學(xué)模型、動(dòng)物模型分析BDE-209與甲狀腺病變及其基因?qū)W改變的關(guān)系,探索其誘導(dǎo)PTC發(fā)生的致瘤機(jī)制,為臨床靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為臨床靶向治療藥物的設(shè)計(jì)和選擇提供新的靶點(diǎn)和思路。第一部分BDE-209在正常人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞及具有不同基因背景的甲狀腺癌細(xì)胞系增殖、凋亡中的研究方法1.分別復(fù)蘇并培養(yǎng)正常人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞Nthy-ori 3-1以及具有不同基因背景的甲狀腺癌細(xì)胞系BHP10-3(甲狀腺乳頭狀癌PTC,伴RET/PTC1基因突變);IHH4(甲狀腺乳頭狀癌PTC,伴BRAFV600E基因突變);BCPAP(甲狀腺乳頭狀癌PTC,伴BRAFV600E基因突變);8505c(間變性甲狀腺癌ATC,伴BRAFV600E基因突變);TT2609(甲狀腺濾泡癌FTC)。2.不同濃度 BDE-209(0.08umol/l、0.16 umol/l、0.32 umol/l、0.64 umol/l、1.25 umol/l、2.50 umol/l)分別染毒 Nthy-ori 3-124h,48h,72h,以未加藥組細(xì)胞為對(duì)照組,MTS法檢測(cè)BDE-209染毒后細(xì)胞的增殖率,檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。3.依據(jù)MTS檢測(cè)結(jié)果繪制生長(zhǎng)曲線,選取3個(gè)時(shí)間段中與IC50值接近的兩個(gè)BDE-209濃度梯度(1.25 umol/l、2.50 umol/l)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。4.以選取的BDE-209濃度分別對(duì)具有不同基因背景的甲狀腺癌細(xì)胞進(jìn)行三個(gè)時(shí)間段的染毒處理,MTS法檢測(cè)藥物處理后各甲狀腺癌細(xì)胞的增殖率及增殖活性。5.檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期;實(shí)時(shí)定量熒光PCR法(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR),以選取濃度梯度 BDE-209(1.25umol/l,2.50 umol/l)染毒細(xì)胞72h后,檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白(cyclinA2、cyclinD1)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的表達(dá);以及濃度梯度BDE-209(1.25 umol/l、2.50 umol/l)分別染毒處理各細(xì)胞系48h后,使用蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)方法檢測(cè)cyclinA2、cyclinD1在蛋白水平的變化。結(jié)果1.MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在24h時(shí),正常人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞Nthy ori3-1在不同濃度BDE-209染毒下的增殖具有趨勢(shì);在48h和72h不同濃度下的BDE-209染毒后Nthy ori3-1細(xì)胞增殖率變化明顯,增殖效應(yīng)在2.50umol/l濃度下達(dá)到最大值20%。此三組實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了 BDE-209促進(jìn)人正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞增殖,且主要以慢性毒性為主,該作用具有明顯的時(shí)間依賴(lài)性和劑量(0.08umol/l-2.50umol/l)依賴(lài)性。2.以選取的濃度梯度BDE-209(1.25 umol/l、2.50 umol/l)染毒具有不同基因背景的癌細(xì)胞,發(fā)現(xiàn):BDE-209促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞增殖,在乳頭狀癌(BHP10-3,BCPAP,IHH4)、間變性癌(8505C)中較濾泡癌(TT2609)中明顯,且BDE-209對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞的作用以慢性毒性為主,具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性。3.流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示:在濃度梯度下,BDE-209染毒后,可以明顯抑制正常人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞及各甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡,其抑制凋亡作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:BDE-209染毒后的正常人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞G1期明顯降低,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而S期升高明顯,具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在甲狀腺癌細(xì)胞中,甲狀腺濾泡性癌TT2609(FTC)和間變性甲狀腺癌8505c(ATC),G1期明顯降低,,S期顯著升高,具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系IHH4(PTC)中,G1期明顯降低,,S期顯著升高,具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而在甲狀腺乳頭狀癌BCPAP(PTC)和BHP10-3(PTC)中,雖然G1期明顯降低,S期明顯升高,但都不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有細(xì)胞的細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果均顯示,S期的細(xì)胞比率(S-phase Fraction,SPF=S/(G0/G1+S+G2/M))升高,因此表明細(xì)胞的增殖率/增殖活性升高,提示正常細(xì)胞存在惡性轉(zhuǎn)化的傾向。5.qRT-PCR 和 Western Blot 結(jié)果顯示,濃度梯度 BDE-209(1.25 umol/l、2.50 umol/l)染毒后的正常人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞Nthy ori3-l及所有甲狀腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白cyclinA2、cyclinD1在mRNA水平和蛋白水平顯著升高。結(jié)論1.BDE-209促進(jìn)正常人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞和所有甲狀腺癌細(xì)胞增殖,具有時(shí)間依賴(lài)性和劑量依賴(lài)性。2.BDE-209通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期蛋白cyclinA2、cyclinD1提高細(xì)胞周期S期的比例,同時(shí)G1期比例降低,從而促進(jìn)正常人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞和所有甲狀腺癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化行為。第二部分BDE-209染毒后影響正常人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞遷移能力、甲狀腺癌細(xì)胞侵襲、遷移以及甲狀腺激素受體表達(dá)量的檢測(cè)方法1.選取高濃度2.50umol/l的BDE-209培養(yǎng)染毒正常人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞Nthy ori3-1進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)正常細(xì)胞的遷移能力。2.2.50umol/l的BDE-209染毒甲狀腺癌細(xì)胞,進(jìn)行transwell小室實(shí)驗(yàn),檢測(cè)癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。3.實(shí)時(shí)定量熒光 PCR 法(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR),檢測(cè)BDE-209(1.25umol/l,2.50 umol/l)染毒細(xì)胞72h后甲狀腺激素受體(TRα、TRβ)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 mRNA 的表達(dá);以及 BDE-209(1.25 umol/l、2.50 umol/l)染毒細(xì)胞48h后,蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)方法檢測(cè)TRα、TRβ在蛋白水平的變化。結(jié)果1.正常人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞染毒BDE-209劃痕實(shí)驗(yàn)顯示:BDE-209作用后的Nthy ori3-1細(xì)胞具有遷移能力。2.Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示:甲狀腺癌細(xì)胞經(jīng)BDE-209染毒后侵襲和遷移能力均增強(qiáng),具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.qRT-PCR 和 Western Blot 結(jié)果顯示,濃度梯度 BDE-209(1.25 umol/l、2.50 umol/l)染毒后的正常人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞Nthy ori3-1及所有甲狀腺癌細(xì)胞的TRα、TRβ表達(dá)在mRNA水平和蛋白水平顯著升高。結(jié)論1.BDE-209影響正常人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的遷移能力,促使正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。2.BDE-209促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞侵襲、遷移能力,使癌細(xì)胞的惡性程度增加。3.BDE-209可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控甲狀腺激素受體TR α、TRβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,進(jìn)而影響正常人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞惡性行為轉(zhuǎn)化及促使甲狀腺癌細(xì)胞惡性程度增加。第三部分BDE-209染毒BALB/c雌性裸鼠皮下成瘤和尾靜脈移植瘤動(dòng)物模型預(yù)實(shí)驗(yàn)方法1.篩選并培養(yǎng)致瘤細(xì)胞BCPAP(甲狀腺乳頭狀癌PTC,伴BRAFV600E基因突變)。5周齡大小BALB/c雌性裸鼠隨機(jī)進(jìn)行分組,每組5只:隨機(jī)分成對(duì)照組(花生油組)和BDE-209超高劑量組(2000ug/(kg · d))。每只BALB/c裸鼠以終體積 0.2ml PBS(phosphate buffered saline),細(xì)胞計(jì)數(shù)為 2.0×106,制成細(xì)胞懸液注射于裸鼠兩側(cè)腋前皮下,腫瘤生成后每?jī)扇沼糜螛?biāo)卡尺測(cè)量腫瘤瘤體長(zhǎng)徑與短徑,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,繪制成裸鼠腫瘤體積指數(shù)曲線;同時(shí),當(dāng)腫瘤瘤體長(zhǎng)徑≥0.4cm(約7天)時(shí),開(kāi)始用超高劑量BDE-2092000ug/(kg·d)隔天灌胃一次,并同時(shí)測(cè)量腫瘤大小,每第二次測(cè)量腫瘤大小同時(shí)稱(chēng)量裸鼠體重并記錄,直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束,繪制裸鼠體重指數(shù)曲線。觀察各組小鼠腫瘤形成情況及對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間腫瘤瘤體大小、體重變化的差別。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,分別留取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組裸鼠的外周全血靜置0.5h后,5000rpm離心20分鐘收取上層血清,放-80℃保存或者立即實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)甲狀腺功能(FT3、FT4、T3、T4、TSH、TR),對(duì)比分析。3.用0.1%戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠,分別取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組裸鼠相關(guān)組織(腫瘤、甲狀腺、肝、脾)稱(chēng)重,計(jì)算并比較各組織重量指數(shù),繪制成重量指數(shù)曲線。4.將上一步驟中取下的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組裸鼠的各組織分為兩份,一份石蠟包埋,制作HE切片進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察,分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組裸鼠組織形態(tài)學(xué)上存在的差別;另一份新鮮組織液氮罐內(nèi)凍存,用于組織RNA提取、總蛋白提取。5.5周齡大小BALB/c雌性裸鼠2只,以終體積0.2ml PBS,細(xì)胞計(jì)數(shù)為1.0×107,制成細(xì)胞懸液經(jīng)尾靜脈注射,觀察裸鼠狀態(tài)。結(jié)果1.持續(xù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察到:隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展,實(shí)驗(yàn)組裸鼠攝食、飲水量較對(duì)照組少;活動(dòng)度降低;裸鼠皮膚褶皺明顯增多,皮膚顏色呈現(xiàn)暗褐色甚至黑褐色。2.實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤體積與對(duì)照組相比,初期差別不明顯,隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展,實(shí)驗(yàn)組裸鼠體腫瘤體積明顯大于對(duì)照組。3.實(shí)驗(yàn)組裸鼠體重變化與對(duì)照組相比較,實(shí)驗(yàn)前期,兩組裸鼠體重均呈現(xiàn)增加趨勢(shì),但實(shí)驗(yàn)組裸鼠體重增加指數(shù)明顯低于對(duì)照組;實(shí)驗(yàn)中后期,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組裸鼠體重均呈現(xiàn)下降趨勢(shì),且實(shí)驗(yàn)組裸鼠體重降低指數(shù)明顯超過(guò)對(duì)照組。4.在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,BDE-209灌胃組小鼠飲食量、飲水量較對(duì)照組明顯降低;實(shí)驗(yàn)后期,實(shí)驗(yàn)組小鼠狀態(tài)明顯差于對(duì)照組,且皮膚顏色呈現(xiàn)藍(lán)黑色。5.血清檢測(cè)甲狀腺功能由于裸鼠血液提取量低,結(jié)果未測(cè)得。6.尾靜脈裸鼠于實(shí)驗(yàn)第7天開(kāi)始出現(xiàn)體重下降,飲食、飲水量下降,精神狀態(tài)下降,皮膚顏色呈現(xiàn)暗褐色,且變化時(shí)間早于實(shí)驗(yàn)組小鼠,裸鼠于實(shí)驗(yàn)第14天發(fā)生死亡。結(jié)論1.BDE-209可以加速皮下移植瘤的生長(zhǎng)速度,促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展。2.BDE-209影響小鼠行為學(xué)和精神狀態(tài)改變。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R736.1

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本文編號(hào)：1767335