本文選題：47kDa + Anxa7�。� 參考：《大連醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：背景:原發(fā)性肝癌是由肝細胞或肝內膽管細胞發(fā)生的惡性腫瘤。其發(fā)病率在消化系統(tǒng)腫瘤中占第三位,全球每年有25萬人,我們國家有11萬人死于肝癌。目前其首選的治療方法為根治性手術切除,但是術后五年的復發(fā)率及轉移率仍然居高不下,預后極差,從診斷到死亡平均生存期為1-4月。遷徙和轉移能力是惡性腫瘤最重要的生物學行為之一,淋巴道轉移是上皮組織來源惡性腫瘤早期轉移的主要方式,在原發(fā)性肝癌中,淋巴道轉移占7.45%。本研究所選用的Hca/A2(Hca-P)細胞和Hca/16A3(Hca-F)細胞是來源于同一親本的細胞株,卻具有不同轉移能力的小鼠肝癌腹水型細胞。Hca-F細胞具有高淋巴道轉移能力,淋巴結轉移率約大于75%,而Hca-P細胞具有低淋巴道轉移能力,淋巴結轉移率約小于25%。本課題組前期研究已利用抑制性消減雜交技術、基因芯片技術、定量蛋白質組學技術等,篩選出了Hca-F細胞和Hca-P細胞差異性表達的基因,在Hca-F細胞中有21個高表達,而在Hca-P細胞中僅有3個高表達。如膜聯(lián)蛋白A7(Annexin A7,Anxa7)等,Anxa7基因在Hca F細胞中的表達明顯高于Hca P細胞。前期研究已發(fā)現(xiàn)這些基因可能與腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉移相關。惡性腫瘤的發(fā)生,是腫瘤細胞分裂與細胞凋亡平衡失調所致,這種平衡的紊亂可以發(fā)生在腫瘤細胞凋亡的任何環(huán)節(jié)當中。體內和體外的研究均提示,凋亡在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。很多學者研究提示,Anxa7的異常表達與多種惡性腫瘤的形成、遷徙及轉移密切相關。因而,對肝癌淋巴道轉移潛能的相關Anxa7基因及蛋白質的研究,有助于闡明肝癌淋巴道轉移的機制,為臨床應用提供新的治療思路。Anxa7有兩種表達亞型,分別為47k Da和51k Da,51k Da亞型蛋白在成熟肌組織中較為常見,而腦和心臟中兩種亞型均存在。本實驗選擇以低淋巴道轉移能力的細胞株為研究對象,通過下調Anxa7基因表達后,確定何種亞型Anxa7對Hca-P凋亡、增殖及遷徙有影響,并探索該亞型參與調控相關凋亡蛋白及其通路的機制。目前研究發(fā)現(xiàn),細胞凋亡存在三條主要通路:內源性線粒體通路、外源性死亡受體通路及內源性內質網(wǎng)通路途徑。在不同的凋亡通路中有多種蛋白參與調控凋亡。研究發(fā)現(xiàn),Bcl-2家族在細胞線粒體凋亡通路中發(fā)揮重要作用,Bcl-2家族的表達和調控是影響細胞凋亡的關鍵因素。Bcl-2屬于抗凋亡蛋白,有抑制細胞凋亡的作用,而Bax是促凋亡蛋白,有促進細胞凋亡的作用。Caspase是一類蛋白酶家族,成員較多,可分為3個亞族:Caspase-1、4、5、11屬于Caspase-1亞族;Caspase-2、9屬于Caspase-2亞族;Caspase-3、6、7、8、10屬于Caspase-3亞族。它們的活性位點均包含半胱氨酸殘基,可以選擇性地切割某些蛋白質,從而造成細胞凋亡。死亡受體為腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族成員的跨膜蛋白受體,主要由Fas/Fas L介導,進而活化caspase-8,形成Fas、Fas L、caspase-8構成的蛋白復合體,其作用與線粒體途徑形成的凋亡小體相似,具有裂解并活化caspase-3的作用,引起細胞凋亡的級聯(lián)反應,導致細胞凋亡發(fā)生。本實驗通過下調47k Da Anxa7表達后,檢測Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase 8、Caspase 12、Fas、Fas-L及Cytochrome C凋亡相關蛋白的改變,進而揭示47k Da Anxa7參與的凋亡通路。此外本實驗還通過采用線粒體膜電位、免疫共沉淀及WB等方法,進一步驗證47k Da Anxa7參與的凋亡通路及相關凋亡蛋白的分布與改變。目的:1.構建p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa7和p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-NC表達載體,穩(wěn)定轉染至低淋巴道轉移細胞株Hca-P細胞中,得到Pd細胞、Pdn細胞。2.研究小鼠肝癌P、Pdn及Pd細胞組中,47k Da與51k Da Anxa7在三組細胞中不同亞細胞定位及表達的變化。3.研究小鼠肝癌Hca-P細胞47k Da Anxa7基因表達水平下調后,P、Pdn及Pd細胞組凋亡及遷徙能力的變化。4.研究小鼠肝癌Hca-P細胞47k Da Anxa7基因表達水平下調后,P、Pdn及Pd細胞組細胞增殖能力及凋亡相關蛋白Bcl-2、Cytochrome-C、Caspase-3、Bax、Caspase-12、Fas、Fas L、Caspase-8的表達變化。5.研究小鼠肝癌Hca-P細胞47k Da Anxa7基因表達水平下調后,Anxa7參與的凋亡通路相關機制的探索。方法:1.構建p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa7和p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-NC表達載體,穩(wěn)定轉染至Hca-P細胞,獲得Pd、Pdn,P細胞為陰性對照。2.應用QRT PCR在m RNA水平驗證,Hca-P細胞在Anxa7基因表達水平表達下調。3.應用Western blot在蛋白質水平驗證,47k Da與51k Da Anxa7表達水平表達下調。4.采用亞細胞蛋白質組學的方法,將P、Pdn及Pd細胞組進行亞細胞組分的提取,并用WB方法對不同亞細胞組分中47k Da與51k Da Anxa7基因兩種亞型進行定位和表達對比。5.利用流式細胞儀檢測細胞凋亡的變化;應用Transwell小室檢測細胞遷徙能力的變化;利用CCK-8實驗檢測細胞增殖能力的改變。6、應用Western blot檢測三組細胞中Bcl-2、Bax、Fas-L、Fas、Cytochrome-C、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-12凋亡相關蛋白的變化。6、應用流式細胞儀,檢測細胞線粒體膜電位的變化。7、應用免疫共沉淀技術檢測與Anaxa7共沉淀的蛋白;采用亞細胞蛋白質組學的方法,并用Western blot方法對各個亞細胞組分中Bcl-2進行定位和表達比較。結果:1.表達載體成功構建;并穩(wěn)定轉染至Hca-P細胞。2.Real time q RT-PCR結果驗證,Hca-P細胞Anxa7基因表達水平明顯下調。3.Western blot結果驗證,47k Da Anxa7在Pd細胞組中蛋白表達水平較P細胞組及Pdn細胞組明顯降低(P0.05),而在P與Pdn細胞組間無明顯差異(P0.05);亞細胞定位及表達顯示,在Anxa7基因表達下調后,47k Da Anxa7在P與Pdn細胞組中同時表達于細胞漿與線粒體;而51k Da Anxa7主要表達于線粒體。4.流式細胞儀檢測47k Da Anxa7基因表達下調后,Pd細胞凋亡明顯高于P細胞和Pdn細胞(P0.05),P細胞和Pdn細胞之間無明顯差異(P0.05)。細胞遷徙實驗檢測Pd細胞細胞遷徙能力明顯低于P細胞和Pdn細胞(P0.05),P細胞和Pdn細胞之間無明顯差異(P0.05)。CCK-8增殖實驗檢測結果提示三組細胞數(shù)量在24小時內無顯著差異(P0.05),在24到72小時的過程中,Pd細胞增殖能力明顯低于P細胞和Pdn細胞(P0.05),P細胞和Pdn細胞增殖能力在各時間段無顯著差異(P0.05)。5.47k Da Anxa7基因表達下調后Bcl-2在Pd細胞組明顯低于P細胞和Pdn細胞組,有顯著差異(P0.05),Caspase-3、胞漿Cyt-C表達在Pd細胞組明顯高于P細胞和Pdn細胞組,有顯著差異(P0.05);Bax、線粒體中Cytochrome-C、Caspase-12、Fas、Fas-L及Caspase-8表達在P細胞、Pdn細胞和Pd細胞組之間無明顯差別(P0.05)。6.線粒體膜電位的變化結果顯示,下調47k Da Anxa7表達的Pd細胞組線粒體膜電位水平降低P細胞組和Pdn細胞組(P0.05);而P細胞組與Pdn細胞組之間無明顯差異(P0.05)。7.免疫共沉淀實驗顯示P細胞組中Anxa7與Bcl-2發(fā)生共沉淀;而未見Anxa7與Bax發(fā)生共沉淀。8.Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn),P細胞組中47k Da Anxa7與Bcl-2在線粒體與細胞漿都有表達,51k Da Anxa7僅表達于線粒體中;在下調47k Da Anxa7表達后,Bcl-2在線粒體與細胞漿的表達都隨之減少。結論:1.利用目的基因成功構建了表達載體,穩(wěn)定轉染至Hca-P細胞,獲得Pd細胞、Pdn細胞。2.Hca-P細胞中有47k Da與51k Da Anxa7兩種亞型表達;主要分布于胞漿及線粒體;Pd細胞中47k Da Anxa7在胞漿及線粒體的表達均減少。3.47k Da Anxa7具有抑制細胞凋亡、促進細胞增殖和遷徙的能力,提示47k Da Anxa7在小鼠肝癌淋巴道轉移機制中起促進作用,并參與細胞凋亡過程。4.47k Da Anxa7主要通過影響抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,并通過線粒體凋亡相關通路參與凋亡過程。5.47k Da Anxa7介導的凋亡可能與外源性死亡受體凋亡通路及內源性內質網(wǎng)凋亡通路無關。6.47k Da Anxa7通過影響Hca-P細胞線粒體膜電位以及改變Bcl-2蛋白在線粒體與胞漿內的表達,促進細胞凋亡。7.47k Da Anxa7與Bcl-2發(fā)生共沉淀,未見與Bax發(fā)生共沉淀。8.47k Da Anxa7可以作為腫瘤凋亡治療的一個潛在藥物治療靶點。
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【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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1 黃玉紅;Asma saleem qazi;Mohmmed mibrahim;張軍;范姝君;唐建武;;不同小鼠腹水型肝癌細胞增殖侵襲能力與膜聯(lián)蛋白A7的亞細胞定位和亞型表達研究[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志;2012年35期

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本文編號：1765762