本文選題：肺癌 + miRNA　； 參考：《東南大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景與目的肺癌是最致命的惡性腫瘤之一,在中國(guó)其發(fā)病率和死亡率均位于首位,嚴(yán)重威脅人們的生命健康和生活質(zhì)量,是我國(guó)的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。探索肺癌的發(fā)病機(jī)理,尋找有效的肺癌篩查和早期診斷的生物標(biāo)志物,是降低肺癌發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵。本研究通過(guò)miRNA及l(fā)ncRNA芯片高通量篩選技術(shù),結(jié)合TCGA大數(shù)據(jù)庫(kù)及生物信息學(xué)分析遴選肺癌相關(guān)候選生物標(biāo)志物;并進(jìn)一步擴(kuò)大人群樣本量,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)并分析miRNA和lncRNA對(duì)肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響及其診斷價(jià)值;最后選取miR-30a-3p、miR-30a-5p及BRE-AS1進(jìn)一步探索其在肺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及可能的調(diào)控機(jī)制,為進(jìn)一步了解肺癌的發(fā)病機(jī)制、篩選肺癌診斷、治療生物標(biāo)志物提供理論依據(jù)。研究方法1.應(yīng)用miRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選肺癌組織及癌旁組織中差異表達(dá)miRNA,結(jié)合TCGA大數(shù)據(jù)庫(kù)及生物信息學(xué)分析構(gòu)建miRNA-mRNA表達(dá)網(wǎng)絡(luò),進(jìn)一步遴選出肺癌相關(guān)miRNA。采用RT-qPCR技術(shù)在肺癌人群中對(duì)篩選出的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行檢測(cè),logistic回歸分析其異常表達(dá)與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系,應(yīng)用ROC曲線下面積評(píng)估候選miRNA在肺癌中的診斷價(jià)值,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析候選miRNA表達(dá)水平與肺癌臨床特征之間關(guān)系。2.應(yīng)用lncRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選差異表達(dá)lncRNA,結(jié)合TCGA大數(shù)據(jù)庫(kù)及生物信息學(xué)分析構(gòu)建lncRNA-mRNA表達(dá)網(wǎng)絡(luò),進(jìn)一步遴選出肺癌相關(guān)lncRNA。在肺癌人群中采用RT-qPCR技術(shù)對(duì)篩選出的差異表達(dá)lncRNA進(jìn)行檢測(cè),logistic回歸分析其異常表達(dá)與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系,應(yīng)用ROC曲線下面積評(píng)估候選lncRNA在肺癌中的診斷價(jià)值,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析候選lncRNA表達(dá)水平與肺癌臨床特征之間關(guān)系。3.利用 miR-30a-3pmimic 和 miR-30a-5pmimic 分別轉(zhuǎn)染 A549 肺癌細(xì)胞,構(gòu)建 miR-30a-3p 和miR-30a-5p過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型,應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中miR-30a-3p和miR-30a-5p表達(dá)情況,確定轉(zhuǎn)染效率。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析過(guò)表達(dá)miR-30a-3p和miR-30a-5p后對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及可能調(diào)控機(jī)制,包括MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期、Annexin-V FITC PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。Western Blot檢測(cè)PI3K-AKT-mTOR通路中關(guān)鍵蛋白水平的表達(dá)。4.構(gòu)建lncRNA BRE-AS1慢病毒過(guò)表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染A549肺癌細(xì)胞構(gòu)建BRE-AS1過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型,應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)后A549細(xì)胞中BRE-AS1的表達(dá)情況,確定慢病毒轉(zhuǎn)染效率。進(jìn)一步在此基礎(chǔ)上分析過(guò)表達(dá)BRE-AS1對(duì)肺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響及可能調(diào)控機(jī)制,包括MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期、Annexin-VAPC7-ADD雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。Western Blot檢測(cè)PI3K-AKT-mTOR通路中關(guān)鍵蛋白水平的表達(dá)。研究結(jié)果1肺癌相關(guān)microRNA的識(shí)別1.1肺癌microRNA差異表達(dá)譜分析miRNA/mRNA表達(dá)譜芯片初步篩選出116個(gè)miRNA和502個(gè)mRNA表達(dá)發(fā)生改變。從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出154個(gè)差異表達(dá)miRNA及5322個(gè)差異表達(dá)mRNA。二者綜合分析,得到交集 miRNA/mRNA 有 29 個(gè)及 417 個(gè)。應(yīng)用 starbase V2.0 數(shù)據(jù)庫(kù),TargetScan 及 miRTarbase預(yù)測(cè)miRNA靶基因,所得結(jié)果與芯片及TCGA交集417個(gè)mRNA構(gòu)建miRNA-mRNA表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖。應(yīng)用DIANA-mirPathV.3對(duì)29個(gè)潛在肺癌相關(guān)miRNA進(jìn)行通路分析,發(fā)現(xiàn)這些miRNA 所調(diào)控靶基因主要參與 Hippo、TGF-beta、Wnt、ErbB、MAPKsignalingpathway 等環(huán)境信息過(guò)程信號(hào)通路及非小細(xì)胞肺癌等人類疾病通路。1.2候選microRNA表達(dá)水平與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及臨床特征關(guān)系的研究通過(guò)RT-qPCR技術(shù)在91例人群組織樣本中檢測(cè)6個(gè)候選miRNA表達(dá)情況,結(jié)果顯示miR-205-5p 表達(dá)顯著上調(diào),miR-27a-5p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30c-2-3p 和 miR-30d-5p表達(dá)顯著下調(diào)(p0.001),與芯片及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)所得結(jié)果一致。Logistic回歸分析顯示,miR-205-5p表達(dá)水平與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)正相關(guān),增加其表達(dá)水平可升高肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR值為 1.287,p0.01) ; miR-27a-5p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30c-2-3p 和 miR-30d-5p 的表達(dá)水平與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)負(fù)相關(guān),增加其表達(dá)水平可降低肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR值分別為0.846、0.700、0.585、0.745、0.479, P0.01)。ROC 特征曲線分析結(jié)果顯示,miR-205-5p、miR-27a-5p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30c-2-3p、miR-30d-5p 單獨(dú)診斷 AUC 分別是 0.728、0.637、0.758、0.772、0.734、0.776 (p0.001),聯(lián)合診斷 AUC 為 0.898(p0. 001),聯(lián)合診斷敏感度和特異度分別為87.7%和84.9%,提示這些miRNA對(duì)肺癌有一定診斷效力、聯(lián)合診斷效果更佳。獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-205-5p、miR-30a-3p、miR-30c-2-3p、miR-30d-5p異常表達(dá)水平與肺癌患者病理分型有關(guān)(p0.05),其表達(dá)差異在肺鱗癌中顯著高于肺腺癌。miR-30a-3p、miR-30c-2-3p異常表達(dá)水平與肺癌患者性別有關(guān)(p0.05),其表達(dá)差異在男性中顯著高于女性。miR-30a-5p、miR-30c-2-3p異常表達(dá)水平與肺癌患者的年齡相關(guān)(p0.05),其表達(dá)差異在大于50歲患者中顯著高于小于50歲患者。提示在不同肺癌病理分型、年齡及性別群體中,miRNA的表達(dá)差異不盡相同,即在特定人群中研究miRNA的表達(dá)可能對(duì)肺癌的診斷、治療及預(yù)后更有意義。2肺癌相關(guān)lncRNA的識(shí)別2.1肺癌lncRNA差異表達(dá)譜分析利用lncRNA表達(dá)譜芯片篩選出385個(gè)肺癌相關(guān)差異表達(dá)lncRNA,其中124個(gè)表達(dá)上調(diào),261個(gè)表達(dá)下調(diào)。從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出337個(gè)肺癌相關(guān)差異表達(dá)lncRNA,其中191個(gè)表達(dá)上調(diào),146個(gè)表達(dá)下調(diào)。二者綜合分析得11個(gè)交集lncRNA,其中表達(dá)下調(diào)lncRNA有3 個(gè),即 MCTS2P、SCARNA12 與 LOC728554,表達(dá)上調(diào)lncRNA 有 8 個(gè),即 LHFPL3-AS2、SFTA1P、LINC00472、GVINP1、BRE-AS1、MIR22HG、LINC00312、MEIS3P1�；� 11 個(gè)候選lncRNA及417個(gè)mRNA構(gòu)建表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖。2.2候選lncRNA表達(dá)水平與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及臨床特征關(guān)系的研究通過(guò)RT-qPCR技術(shù)在91例肺癌人群組織中檢測(cè)2個(gè)候選lncRNA表達(dá)情況,結(jié)果顯示LINC00312、BRE-AS1均表達(dá)下調(diào)(p0.05),與芯片篩選結(jié)果及TCGA所得結(jié)果一致。Logistic回歸分析顯示,LINC00312和BRE-AS1表達(dá)水平與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)負(fù)相關(guān),增加其表達(dá)水平可降低肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR值分別為0.739和0.362,p0. 001)。ROC曲線分析結(jié)果顯示,LINC00312和BRE-AS1單獨(dú)診斷AUC分別是0.784和0.916 (p0.05),兩者聯(lián)合診斷AUC為0.922 (p0.05),兩者聯(lián)合診斷敏感度和特異度分別為87.8%和84.6%,提示聯(lián)合診斷可提高肺癌診斷效能。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),LINC00312異常表達(dá)水平與肺癌患者性別、年齡有關(guān)(p0.05),其表達(dá)差異在大于50歲男性患者中顯著高于小于50歲女性患者。BRE-AS1異常表達(dá)水平與肺癌患者性別、年齡及病理類型有關(guān)(P0.05),其表達(dá)差異在大于50歲的男性肺鱗癌患者中顯著高于小于50歲的女性肺腺癌患者。提示在不同肺癌病理分型、年齡及性別群體中,lncRNA的表達(dá)差異不盡相同,即在特定人群中研究lncRNA的表達(dá)可能對(duì)肺癌的診斷、治療及預(yù)后更有意義。3 MiR-30a-3p和miR-30a-5p在肺癌中的生物學(xué)功能及機(jī)制研究3.1 MiR-30a-3p和miR-30a-5p的生物信息學(xué)分析應(yīng)用DIANA-mirPath 3.0對(duì)miR-30a-3p和miR-30a-5p進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),二者與多個(gè)腫瘤如Non small cell lung cancer等發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),還參與如PI3K-Akt signaling pathway、Foxo signaling pathway、p53 signaling pathway 等多個(gè)腫瘤相關(guān)通路的調(diào)控。此外,通過(guò) miR-30a-3p 和 miR-30a-5p 潛在靶基因在 Small cell lung cancer 和 Non small cell lung cancer通路上的作用位點(diǎn),進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)miR-30a-3p和miR-30a-5p可能通過(guò)對(duì)PI3K-Akt通路中相關(guān)蛋白的調(diào)控,進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和凋亡等生物學(xué)過(guò)程。3.2 MiR-30a-3p和miR-30a-5p對(duì)A549細(xì)胞的生物學(xué)功能研究miR-30a-3p和miR-30a-5p細(xì)胞本底值的RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與16HBE細(xì)胞相比,A549細(xì)胞中miR-30a-3p和miR-30a-5p均呈低表達(dá)狀態(tài)。與陰性對(duì)照組相比,mimic轉(zhuǎn)染組中miR-30a-3p和miR-30a-5p表達(dá)水平均顯著升高(p0.05)。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果顯示,miR-30a-3p和miR-30a-5pmimic轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞增殖能力在24h、36h、48h均顯著低于陰性對(duì)照組(p0.01),提示在A549細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-30a-3p和miR-30a-5p可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞周期結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,miR-30a-3pmimic轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞S期比例明顯增加(p0.05),提示A549細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-30a-3p可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于S期。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,miR-30a-3p和miR-30a-5p mimic轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞凋亡率顯著升高(p0.05),提示A549細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-30a-3p和miR-30a-5p可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加。3.3 MiR-30a-3p和miR-30a-5p對(duì)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的調(diào)控研究對(duì)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè),結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,miR-30a-3pmimic 和 miR-30a-5pmimic 轉(zhuǎn)染組中 AKT3、mTOR、S6K 表達(dá)水平明顯下降。提示miR-30a-3p和miR-30a-5p可能通過(guò)PI3K-AKT3-mTOR通路影響肺癌的發(fā)生發(fā)展。4 LncRNA BRE-AS1在肺癌中的生物學(xué)功能及機(jī)制研究4.1慢病毒LncRNABRE-AS1過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子菌液測(cè)序結(jié)果與目的基因序列比對(duì)分析結(jié)果說(shuō)明測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致,BRE-AS1過(guò)表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建成功。4.2 LncRNA BRE-AS1對(duì)A549細(xì)胞的生物學(xué)功能研究慢病毒BRE-AS1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),LV-BRE-AS1組中BRE-AS1表達(dá)水平是陰性對(duì)照組的59.756倍(p0.05),慢病毒轉(zhuǎn)染效率較好。MTT結(jié)果顯示LV-BRE-AS1組細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力明顯低于陰性對(duì)照組(p0.05),提示過(guò)表達(dá)BRE-AS1可抑制A549細(xì)胞增殖能力。細(xì)胞周期結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,LV-BRE-AS1組細(xì)胞S期比例減少,G2/M期比例增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),提示過(guò)表達(dá)BRE-AS1可誘導(dǎo)A549細(xì)胞阻滯于G2/M期。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,LV-BRE-AS1組中晚期及總凋亡比例增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),提示過(guò)表達(dá)BRE-AS1可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡升高。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)慢病毒BRE-AS1過(guò)表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后肺癌A549細(xì)胞遷移能力與陰性對(duì)照比較略呈降低趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。4.3 LncRNA BRE-AS1對(duì)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的調(diào)控研究對(duì)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè),結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,LV-BRE-AS1組中PI3K、AKT3、mTOR、S6K及BCL-XL蛋白表達(dá)水平明顯降低。提示BRE-AS1可能通過(guò)對(duì)PI3K-AKT3-mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)影響參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。研究結(jié)論1.本研究通過(guò)miRNA芯片、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)及miRNA-mRNA表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析,在肺癌組織中篩選出29個(gè)差異表達(dá)miRNA。人群樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-205-5p在肺癌組織中高表達(dá),與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān),miR-27a-5p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30c-2-3p、miR-30d-5p 在肺癌組織中低表達(dá),與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。提示miRNA聯(lián)合分析可提高肺癌的診斷效能,具有較高的應(yīng)用價(jià)值,在不同性別、年齡及病理類型的特定人群中進(jìn)一步開展肺癌相關(guān)miRNA研究可能更具有實(shí)際意義。2.本研究通過(guò)lncRNA芯片、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)及l(fā)ncRNA-mRNA表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析,在肺癌組織中篩選出 11 個(gè)差異表達(dá) LncRNA:MCTS2P、SCARNA12、LOC728554、LHFPL3-AS2、SFTA1P、LINC00472、GVINP1、BRE-AS1、MIR22HG、LINC00312、MEIS3P1。人群樣本檢測(cè)首次發(fā)現(xiàn)LINC00312和BRE-AS1在肺癌組織中低表達(dá),與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。提示lncRNA聯(lián)合分析可提高肺癌的診斷效能,具有較高的應(yīng)用價(jià)值,在不同性別、年齡及病理類型的特定人群中進(jìn)一步開展肺癌相關(guān)lncRNA研究可能更具有實(shí)際意義。3.過(guò)表達(dá)miR-30a-3p和miR-30a-5p可抑制A549細(xì)胞增殖、引起細(xì)胞S期周期阻滯,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加。二者可通過(guò)對(duì)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)影響參與肺癌的調(diào)控。4.本研究首次研究BRE-AS1在肺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及機(jī)制,過(guò)表達(dá)BRE-AS1可抑制A549細(xì)胞增殖、改變細(xì)胞G2/M周期比例、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加,BRE-AS1可通過(guò)對(duì)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)影響參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 程艷香;陳干濤;楊瀟;洪莉;;LncRNA在子宮脫垂組織中表達(dá)譜的變化[J];中國(guó)計(jì)劃生育和婦產(chǎn)科;2016年03期

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本文編號(hào)：1761397