本文選題：淋巴瘤 + 大B細(xì)胞��； 參考：《東南大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：第一部分microRNA-224在DLBCL細(xì)胞株中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞株增殖、侵襲、凋亡的影響目的：microRNA-224 (miR-224)在細(xì)胞中參與調(diào)控多種生物學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)通路,通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)來(lái)影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)中,其作用機(jī)制仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究活化細(xì)胞型、生發(fā)中心型DLBCL細(xì)胞株以及正常B淋巴細(xì)胞中miR-224的表達(dá)水平；以及干擾miR-224在DLBCL細(xì)胞株中的表達(dá)后對(duì)細(xì)胞株的增殖、侵襲能力和凋亡的影響。方法：采用膠原酶和胰蛋白酶原消化碎化的扁桃體,并使用流式細(xì)胞儀分選、提取表達(dá)CD19+B淋巴細(xì)胞；采用qRT-PCR檢測(cè)比較彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株OCI-LY3、OCI-LY10(ABC-type)和OCI-LY18、OCI-LY19(GCB-type)以及正常CD19+B淋巴細(xì)胞的miR-224的表達(dá)水平;使用mimic-miR-224轉(zhuǎn)染OCI-LY3、OCI-LY10和OCI-LY18、OCI-LY19后,采用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后OCI-LY3、OCI-LY10和OCI-LY18、OCI-LY19的miR-224的表達(dá)水平的變化；并采用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后OCI-LY3、OCI-L1Y10和OCI-LY18、OCI-LY19細(xì)胞增殖水平的變化；使用Transwell法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后對(duì)OCI-LY3、OCI-LY10和OCI-LY18、OCI-LY19細(xì)胞的體外侵襲能力的影響；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后對(duì)OCI-LY3、 OCI-LY10和OCI-LY18、OCI-LY19細(xì)胞的凋亡的影響。結(jié)果：使用Ficoll離心獲取單個(gè)核細(xì)胞層后,采用流式細(xì)胞術(shù)分選可獲得純度90%以上表達(dá)CD19+B淋巴細(xì)胞；qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明DLBCL細(xì)胞株中miR-224的表達(dá)明顯低于正常B淋巴細(xì)胞(P0.05),且ABC-型與GCB-型DLBCL細(xì)胞株的miR-224表達(dá)水平無(wú)顯著差異；qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示mimic-miR-224轉(zhuǎn)染后ABC-型與GCB-型DLBCL細(xì)胞株的miR-224表達(dá)水平顯著增加(P0.01)；MTT結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染24h、48 h、72 h和96 h后,OCI-LY3/mimic-miR-224細(xì)胞在48h、72h和96h的增殖能力較OCI-LY3/mimic-control分別下降至86%(P0.05),82%(P0.05),74%(P0.01); OCI-LY10/ mimic-miR-224細(xì)胞在48h、72h和96h的增殖能力較OCI-LY10/mimic-control分別下降至79%(P0.01),75%(P0.01),68%(P0.01); OCI-LY 18/mimic-miR-224細(xì)胞在48h、72h和96h的增殖能力較OCI-LY18/mimic-control分別下降至83%(P0.01),78%(P0.01),71%(P0.01);OCI-LY19/mimic-miR-224細(xì)胞在48h、72h和96h的增殖能力較OCI-LY19/mimic-control分別下降至85%(P0.01),78%(P0.01),69%(P0.01);細(xì)胞體外侵襲力測(cè)定結(jié)果顯示：OCI-LY3/mimic-miR-224、OCI-LY10/mimic-miR-224、OCI-LY18/mimic-miR-224及OCI-LY19/mimic-miR-224組中穿膜細(xì)胞的數(shù)量分別是OCI-LY3/mimic-control、 OCI-LY10 mimic-control、OCI-LY18/mimic-control及OCI-LY19/mimic-control組的71%(P0.05)、60%(P0.01)、82%(P0.05)及81%(P0.05)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：OCI-LY3/mimic-miR-224、OCI-LY10/mimic-miR-224、OCI-LY18/mimic-miR-224及OCI-LY19/mimic-miR-224組細(xì)胞的凋亡率顯著高于OC1-LY3/mimic-control、OCI-LY10/mimic-control、OCI-LY18/mimic-control及OCI-LY19/mimic-control組(P0.05)。結(jié)論：彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞miR-224表達(dá)水平明顯低于CD19+B淋巴細(xì)胞的miR-224表達(dá)水平,且ABC-型與GCB-型DLBCL細(xì)胞株的miR-224表達(dá)水平無(wú)顯著差異；使用RNA干擾技術(shù)特異性增加OCI-LY3、OCI-LY10、OCI-LY18和OCI-LY19細(xì)胞miR-224表達(dá)后,細(xì)胞增殖、侵襲能力受到明顯抑制,凋亡增加,說(shuō)明miR-224表達(dá)水平的變化能影響OCI-LY3、OCI-LY10、OCI-LY18和OCI-LY19細(xì)胞生物學(xué)行為的改變；推測(cè)miR-224表達(dá)失調(diào)在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展中起始動(dòng)、觸發(fā)作用。第二部分miR-224在DLBCL細(xì)胞株中靶基因預(yù)測(cè)、篩選及驗(yàn)證目的：準(zhǔn)確預(yù)測(cè)miR-224在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中的靶基因?qū)τ谘芯縨iR-224在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中的功能以及分析miR-224所參與的生物學(xué)過(guò)程有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)使用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)并篩選miR-224靶基因,采用分子生物學(xué)方法驗(yàn)證miR-224靶基因從而為發(fā)病機(jī)制、治療以及預(yù)后評(píng)判提供新的策略和思路。方法：使用nicroRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScan 5.1、miRDB、miRWalk、 RNA22及miRanda預(yù)測(cè)miR-224的靶基因：依據(jù)預(yù)測(cè)軟件積分及結(jié)合彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的免疫化學(xué)治療特征篩選miR-224的靶基因；采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)直接驗(yàn)證miR-224的靶基因：使用qRT-PCR、流式細(xì)胞儀、Western Blot方法檢測(cè)mimic-miR-224轉(zhuǎn)染OCI-LY3、OCI-LY10和OCI-LY18、OCI-LY19后靶基因mRNA及靶基因蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：TargetScan 5.1、miRDB、miRWalk、RNA22及miRanda均準(zhǔn)確預(yù)測(cè)CD59為miR-224的靶基因；熒光素酶報(bào)告基因方法實(shí)驗(yàn)證明了CD59是miR-224的靶基因；流式細(xì)胞術(shù)、Western blot及qRT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)mimic-miR-224轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-224的表達(dá)量顯著增加,CD59的蛋白表達(dá)明顯降低(P0.05),CD59的mRNA的量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：CD59為miR-224的靶基因；miR-224在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)CD59表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。第三部分microRNA-224在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者中的表達(dá)及臨床意義目的：miR-224在DLBCL細(xì)胞株中低表達(dá)已得到證實(shí),其表達(dá)水平的變化對(duì)DLBCL細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生影響,miR-224表達(dá)失調(diào)或?yàn)镈LBCL的發(fā)生、發(fā)展中起始動(dòng)、觸發(fā)作用：本實(shí)驗(yàn)擬分析miR-224在DLBCL患者中的表達(dá)及其與臨床病理特征以及預(yù)后之間的關(guān)系。方法：選取168例DLBCL患者為研究對(duì)象,采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)其miR-224的相對(duì)表達(dá)量,并探討miR-224表達(dá)水平與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：168例DLBCL患者淋巴組織中miR-224表達(dá)水平均值為0.97±0.33,正常淋巴結(jié)組織表達(dá)水平均值為1.87±0.43,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；miR-224在DLBCL患者中的表達(dá)與患者年齡(P=0.4342)、性別(P=0.6129)、疾病分期(P=0.2498)、國(guó)際預(yù)后指數(shù)(P=0.3547)、LDH(P=0.3985)均無(wú)明顯相關(guān)性；miR-224在GCB患者組與ABC患者組表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P0.05)；miR-224表達(dá)水平在CR組最高,PR組次之,SD+PD組最低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；以DLBCL患者miR-224表達(dá)水平的平均值為閾值,將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,兩組患者的5年無(wú)進(jìn)展生存率及總生存率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均0.05),前者均較后者高。結(jié)論：miR-224可能作為抑癌基因參與了DLBCL的發(fā)生、發(fā)展,其表達(dá)水平可作為DLBCL患者預(yù)后判斷的標(biāo)志物,有助于指導(dǎo)臨床個(gè)體化及分層治療,從而改善患者預(yù)后。第四部分CD59在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者中的表達(dá)及臨床意義目的：miR-224在DLBCL患者病理組織中表達(dá)水平較正常對(duì)照組為低,且證實(shí)miR-224表達(dá)水平與臨床病理特征及預(yù)后的有關(guān)；本實(shí)驗(yàn)擬分析miR-224的靶基因CD59在DLBCL患者病理組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征以及預(yù)后之間的關(guān)系。方法：選取186例DLBCL患者為研究對(duì)象,采用組織微陣列及免疫組化方法檢測(cè)其CD59的相對(duì)表達(dá)量,并探討CD59表達(dá)水平與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：186例DLBCL患者中,有151例患者病理組織免疫組化提示CD59陽(yáng)性,其中68例為GCB型DLBCL (36.6%),83例患者為ABC型DLBCL(44.6%)：在35例CD59陰性表達(dá)的DLBCL患者中,18例為GCB型DLBCL(9.7%),17例患者為ABC型DLBCL (9.1%); ABC型DLBCL患者與GCB型DLBCL患者淋巴組織中CD59表達(dá)水平兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。CD59在DLBCL患者中的表達(dá)與患者年齡、性別、疾病分期、國(guó)際預(yù)后指數(shù)、LDH均無(wú)相關(guān)性。獲得完全緩解的患者中的CD59表達(dá)水平顯著低于未達(dá)完全緩解的患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。其中疾病進(jìn)展及疾病穩(wěn)定組CD59表達(dá)量最高,部分緩解組次之,完全緩解組CD59表達(dá)水平最低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。多因素統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示在DLBCL患者中表達(dá)CD59的腫瘤細(xì)胞超過(guò)50%以及存有B癥狀和高IPI分值是獨(dú)立的預(yù)后不良因素。以CD59表達(dá)水平的平均值為閾值,將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,兩組患者的2年無(wú)進(jìn)展生存率及總生存率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,后者均較前者高。結(jié)論：CD59其表達(dá)水平可作為DLBCL患者預(yù)后判斷的標(biāo)志物,可在早期篩選預(yù)后不良的病例,有助于臨床治療方案的選擇及改善預(yù)后。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R733.1

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本文編號(hào)：1750896