本文選題：腫瘤干細胞　切入點：miRNAs　出處：《第三軍醫(yī)大學》2015年博士論文

【摘要】：研究背景目前,肺癌是死亡率居于首位的腫瘤疾病,肺腺癌是最主要的亞型,約占肺癌的40%。肺腺癌早期無癥狀或局部癥狀較少,發(fā)展進程相對較長,晚期通常易復發(fā)。過去十年,雖然針對EGFR和ALK的治療取得相應(yīng)的進展,但是由于化療抵抗,復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移仍然是面臨的挑戰(zhàn),晚期患者五年15%的存活率并沒有明顯改善。有學者提出,在惡性腫瘤組織中存在著一小部分具有干細胞樣特性的細胞亞群,也就是被普遍稱為的腫瘤干樣細胞(cancer stem-like cells,CSLCs)或稱腫瘤起始細胞(tumor initiating cells,TICs),不僅具有與干細胞相類似的自我更新和多項分化的能力,而且被認為可能是多種類型腫瘤的起源。研究表明,在肺癌及肺腺癌中也存在有腫瘤干細胞,被稱為肺癌干細胞(lung cancer stem cells,LCSCs),其對化療藥物,放射治療具有抵抗能力,因此提出肺癌干細胞是肺癌復發(fā),轉(zhuǎn)移的根本。換言之,肺癌也是一種干細胞疾病,因此,從肺腺癌干細胞這一角度作為切入點進一步研究將為治療肺腺癌開拓新理念。腫瘤干細胞除了比普通腫瘤細胞在侵襲轉(zhuǎn)移能力上更強,以及對放化療抵抗能力之外,其本質(zhì)的區(qū)別是具有干細胞特性,也即自我更新(self-renewal)。無論是腫瘤的起始進展還是復發(fā)和轉(zhuǎn)移灶的形成均有賴于腫瘤干細胞的自我更新。因此,闡明腫瘤干細胞的自我更新機制有助于研制出改善肺癌生存率的有效藥物。腫瘤干細胞的自我更新不僅受到內(nèi)在信號的調(diào)控,比如Notch,Hedgehog,EGF,FGF,IGF等信號通路,同時也受到mi RNAs的調(diào)控,mi RNAs(microRNAs)是一類近年來新發(fā)現(xiàn)的長約19-22個核苷酸(nt)的非編碼單鏈小分子RNA,主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因(target)蛋白的表達。眾多的證據(jù)表明,mi RNA參與腫瘤的調(diào)控作用不容忽視。類似于癌基因或抑癌基因在腫瘤細胞的一系列的生物學過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。mi RNA的序列雖小,但是僅一個mi RNA就可以調(diào)控多個靶基因,形成序列放大的基因調(diào)控通路;而一個miRNA也可以受多個基因的調(diào)控,從而在生物體內(nèi)構(gòu)成了一個龐大的復雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。目前研究發(fā)現(xiàn),miRNA參與了干細胞以及腫瘤干細胞自我更新和多向分化潛能的調(diào)節(jié),是mirna領(lǐng)域的研究熱點,方興未艾。例如mir-290、mir-296通過靶向自我更新相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子oct-4、tcf3、sox2、nanog調(diào)控胚胎干細胞的自我更新和多向分化。let-7通過h-ras和hmga2調(diào)控乳腺癌干細胞的自我更新及惡性增殖等。那么,肺癌干細胞的自我更新是如何被調(diào)控的呢?是否有mirnas調(diào)控了肺癌干細胞的自我更新呢?它們是怎樣參與肺癌干細胞自我更新的呢?對指導臨床工作又有怎樣的意義呢?這些問題成為本課題研究的主要內(nèi)容。研究目的1.檢測肺腺癌干細胞中mir-214的表達。2.明確mir-214在肺腺癌干細胞自我更新中的調(diào)控作用。3.探討mir-214調(diào)控肺腺癌干細胞自我更新的具體機制。研究方法一、mir-214在肺腺癌干細胞中的表達1.通過過表達mir-214,采用real-timepcr方法,比較a549,nci-h1650肺癌細胞系來源的cslcs和非cslcs中干細胞標記物的表達。2.通過過表達mir-214,采用成球?qū)嶒灆z測a549,nci-h1650肺癌細胞系“球狀”生長能力,流式細胞技術(shù)驗證cd133+/epcam+比例。3.采用real-timepcr檢測a549,nci-h1650肺癌細胞系來源的cslcs和非cslcs中mir-214的表達;通過a549,nci-h1650來源的cslcs再分化實驗,檢測分化過程中mir-214的表達情況。二、mir-214在laccslcs自我更新中的作用1.通過構(gòu)建sh-mir-214慢病毒,采用成球?qū)嶒灆z測mir-214體外對a549,nci-h1650肺癌細胞系來源的cslcs和原代肺癌細胞來源的cslcs自我更新的作用。2.通過構(gòu)建sh-mir-214慢病毒,采用real-timepcr,免疫熒光技術(shù),western-blot檢測干細胞標記物(nanog,oct-4,sox-2,epcam)的表達。3.通過構(gòu)建sh-mir-214慢病毒,采用pcrarray檢測mir-214對自我更新相關(guān)信號通路的影響。4.通過構(gòu)建sh-mir-214慢病毒后裸鼠體內(nèi)荷瘤實驗研究mir-214對nci-h1650肺癌細胞系來源的cslcs體內(nèi)成瘤能力的影響。三、mir-214調(diào)控laccslcs自我更新作用的機制1.通過生物信息學方法和自我更新相關(guān)基因篩選mir-214的靶基因,并通過雙熒光素酶報告基因,real-timepcr,western-blot和免疫熒光等實驗驗證。2.通過雙轉(zhuǎn)染sh-mir-214sh-ctnnbip1,采用成球?qū)嶒?real-timepcr,,western-blot和免疫熒光染色技術(shù)驗證mir-214通過靶基因ctnnbip1在laccslcs自我更新中的作用。3.通過免疫組織化學等方法研究ctnnbip1在iiia期肺腺癌患者中的臨床意義。研究結(jié)果1.mir-214在laccslcs中高表達我們通過mir-214過表達慢病毒載體技術(shù),檢測了mir-214對a549,nci-h1650肺癌細胞成球能力的作用,驗證了干細胞標記物的表達;比較了a549,nci-h1650肺癌細胞系及原代肺癌來源的laccslcs和非cslcs之間mir-214的表達差異,通過成球?qū)嶒灪蛂eal-timepcr結(jié)果顯示:過表達mir-214后,肺癌細胞a549,nci-h1650表現(xiàn)出成“球狀”生長,其干細胞比例及標志物表達明顯高于對照組;通過real-timepcr結(jié)果顯示:a549,nci-h1650及原代肺癌來源的cslcsmir-214表達高于非cslcs;再分化過程中mir-214表達呈下降趨勢。提示mir-214在laccslcs自我更新中發(fā)揮重要作用,因此,我們選擇對mir-214參與laccslcs自我更新進行深入研究。2.mir-214促進laccslcs自我更新為了進一步明確mir-214在laccslcs中的作用,我們通過構(gòu)建sh-mir-214慢病毒轉(zhuǎn)染建立穩(wěn)定表達的laccslcs,通過衡量sh-mir-214轉(zhuǎn)染組與對照組成球數(shù)量和成球大小,證明mir-214促進laccslcs的自我更新。通過real-timepcr證實了下調(diào)mir-214表達后,與對照組相比,a549,nci-h1650來源的cslcs干細胞標記物(nanog、oct-4、epcam)mrna表達水平明顯降低。通過western-blot,免疫熒光技術(shù)進一步證明sh-mir-214轉(zhuǎn)染組nanog、sox-2、oct-4的蛋白表達顯著低于對照組。同時,pcrarray結(jié)果顯示:下調(diào)mir-214表達的laccslcs自我更新相關(guān)信號通路受到顯著的影響。以上結(jié)果表明,mir-214能夠促進肺腺癌干細胞自我更新。此外,通過體內(nèi)荷瘤實驗證明mir-214在體內(nèi)成瘤方面具有更強的致瘤作用。3.mir-214通過靶基因ctnnbip1調(diào)控laccslcs自我更新通過生物信息學預(yù)測mir-214的潛在靶基因,結(jié)合pcrarray結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)mir-214后影響最為顯著的自我更新相關(guān)通路為wnt,在此基礎(chǔ)上篩選出ctnnbip1為潛在靶基因,通過雙熒光素酶報告基因證實了ctnnbip1是mir-214的直接靶基因。real-timepcr結(jié)果同時表明肺癌組織中mir-214與ctnnbip1mrna的表達呈顯著負相關(guān)。通過western-blot,免疫熒光進一步驗證了下調(diào)mir-214表達后,ctnnbip1蛋白水平表達顯著升高。提示mir-214能夠調(diào)控ctnnbip1蛋白水平的表達。為了明確miR-214是否通過靶基因CTNNBIP1參與肺癌干細胞自我更新,我們通過雙轉(zhuǎn)染sh-mi R-214sh-CTNNBIP1,檢測CSLCs的成球數(shù)量和成球大小的改變,發(fā)現(xiàn)雙轉(zhuǎn)染的CSLCs成球數(shù)量和成球大小顯著高于sh-mi R-214轉(zhuǎn)染組。通過western-blot結(jié)果表明,相較于sh-mi R-214轉(zhuǎn)染組,sh-miR-214sh-CTNNBIP1雙轉(zhuǎn)染組CTNNBIP1蛋白水平表達顯著降低,β-catenin,Cyclin D1,Oct-4,Sox-2表達水平顯著升高。以上結(jié)果表明,mi R-214是通過CTNNBIP1參與LAC CSLCs的自我更新。為了驗證在肺腺癌中CTNNBIP1的表達是否影響患者的生存預(yù)后,我們找到IIIa期肺腺癌患者病理標本,采用免疫組化的方法檢測CTNNBIP1在肺腺癌中的表達,發(fā)現(xiàn)高分化肺癌組織中CTNNBIP1表達高于低分化肺癌組織,高分化肺癌組織中Ki67表達高于低分化肺癌組織;經(jīng)統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)CTNNBIP1的表達與肺腺癌的分化程度呈正相關(guān),且與Ki67的表達呈反相關(guān);進一步通過Kaplan-Meier生存曲線發(fā)現(xiàn),CTNNBIP1高表達組生存時間顯著高于低表達組,提示CTNNBIP1與肺腺癌預(yù)后密切相關(guān)。研究結(jié)論在肺腺癌中,mi R-214在LAC CSLCs中高表達,并通過CTNNBIP1促進LAC CSLCs的自我更新和小鼠體內(nèi)成瘤,臨床上,CTNNBIP1的表達與生存期密切相關(guān),是肺腺癌預(yù)后的重要指標。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 吳明富;楊潔;項濤;史艷燕;劉麗江;;miR-21 Targets Fas Ligand-mediated Apoptosis in Breast Cancer Cell Line MCF-7[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2014年02期

2 ;Identification of plasma microRNA-21 as a biomarker for early detection and chemosensitivity of non-small cell lung cancer[J];癌癥;2011年06期

，

本文編號：1729558