本文選題：TOPK　切入點：Src　出處：《華中科技大學》2016年博士論文

【摘要】：目的：TOPK作為一種絲／蘇氨酸蛋白激酶,在多種腫瘤中呈高表達,并能促進結腸癌的發(fā)生,但其激活機制尚不清楚。Src的活性在80%的結腸癌中有增強,且TOPK存在Src磷酸化保守序列。本研究將探索Src是否為TOPK的直接上游激酶,并確認其磷酸化位點,制備磷酸化抗體探討TOPK被Src磷酸化后在結腸癌發(fā)生中的作用及其機制。方法：1.通過體外激酶實驗驗證Src是否可磷酸化TOPK,利用NetPhos2.0軟件及肽譜磷酸化方法篩選出其可被磷酸化的位點。2.制備相應的磷酸化抗體(p-TOPK(Y74)、p-TOPK(Y272)),構建TOPKY74、Y272單突變和Y74Y272雙突變原核表達質粒,并表達蛋白,通過體外激酶實驗驗證Src在Y74、Y272磷酸化TOPK。3.利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀測Src是否與TOPK共定位,并通過pull-down技術檢測細胞內Src是否與TOPK共結合。4.瞬時轉染pcDNA3-HA-TOPK和pcDNA4-His-Src到HEK293T細胞,EGF刺激后,通過western blot法檢測細胞內p-TOPK (Y74)的表達情況。5.在結腸癌細胞內分別給予EGF時間依賴性刺激,用Src抑制劑達沙替尼作用以及建立src基因沉默穩(wěn)定細胞系,用磷酸化抗體驗證細胞內Src可在Y74磷酸化TOPK。6.構建TOPKY74、Y272單突變和Y74Y272雙突變真核表達質粒,在JB6和SW480細胞建立TOPK單突變和雙突變穩(wěn)定細胞系,通過生長曲線檢測細胞的增殖變化,利用軟瓊脂克隆形成實驗檢測位點突變后細胞的錨定非依賴性生長能力(即克隆形成能力)的改變。7.在TOPK野生型和雙突變型JB6穩(wěn)定細胞系(JB6/WT和JB6/FF),敲除Src后的MEF細胞系(Src+/+和Src-/-)及達沙替尼作用后的結腸癌細胞系SW480、HCT15及HCT116中用western blot法檢測TOPK的底物p-Histone H3 (S10)的表達,觀察TOPK的活性變化情況。8.將建立的TOPK野生型和雙突變型SW480穩(wěn)定細胞系細胞(SW480/WT/和SW480/FF)注射入裸鼠體內,通過裸鼠荷瘤實驗檢測FF/SW480細胞成瘤能力的變化情況。9.在HEK293T細胞中過表達Src、TOPK及泛素分子Ubiquitin,通過免疫沉淀實驗檢測TOPK泛素化結合能力的變化情況。10.用放線菌酮(CHX)分別作用于瞬時轉染野生型TOPK (TOPK-WT)和雙突變型TOPK(TOPK-FF)的HEK293T細胞以及Src+/+和Src-/- MEFs, western blot法檢測TOPK的半衰期。結果：1.體外激酶實驗結果顯示活性Src可磷酸化無活性TOPK。NetPhos2.0軟件打分預測和肽譜磷酸化篩選出Y74和Y272為Src磷酸化TOPK的酪氨酸位點。2.體外激酶實驗驗證制備的p-TOPK (Y74)抗體識別TOPK第Y74位點的磷酸化。3.激光共聚焦結果顯示Src在細胞內與TOPK共定位,pull-down結果表明Ni-NTA-His-TOPK可結合細胞內Src。4.共轉染pcDNA3-HA-TOPK和pcDNA4-His-Src到HEK293T細胞后,p-TOPK (Y74)抗體能識別磷酸化的TOPK,并且EGF刺激增強了p-TOPK(Y74)的表達。5.分別用EGF刺激結腸癌細胞SW480 0,5,15,30分鐘后,內源性p-TOPK(Y74)的表達水平增強；用Src抑制劑達沙替尼作用于結腸癌細胞24h或者沉默結腸癌細胞內Src后,內源性p-TOPK (Y74)的表達水平降低。6.在過表達TOPK野生型(WT)、單突變(74F；272F)和雙突變(FF)的JB6和SW480細胞系中,各突變組細胞生長較野生型組慢(P0.05,差異具有統(tǒng)計學意義),并且突變組細胞的錨定非依賴性生長能力較野生型組降低,即突變后細胞的腫瘤發(fā)生能力下降。7.與JB6/WT組相比較,JB6/FF組細胞p-Histone H3 (S10)的表達明顯降低；而在Src-/- AMEFs和達沙替尼作用后的結腸癌細胞系SW480、HCT15以及HCT116中,p-Histone H3 (S10)的表達也降低,Src磷酸化TOPK增強了TOPK的活性。8.裸鼠荷瘤實驗顯示SW480/FF組腫瘤增長速度明顯減慢(P0.05,差異具有統(tǒng)計學意義),最終形成的腫瘤體積也明顯較SW480/WT組小,并且SW480/FF組腫瘤中p-Histone H3(S 10)的表達水平明顯低于SW480/WT組。9.共轉染Src后,TOPK的泛素化結合水平明顯降低,說明Src抑制了TOPK的泛素化誘導的降解途徑。10. TOPK-FF組細胞中TOPK的半衰期較TOPK-WT短；Src"-/- MEFs中TOPK的穩(wěn)定性也較Src+/+ MEFs差,說明Src增強TOPK的穩(wěn)定性。結論：Src在Y74、Y272磷酸化TOPK,增強其活性和穩(wěn)定性,從而促進了結腸癌的發(fā)生。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect and mechanism of TOPK on the phosphorylation of TOPK in colon cancer cells . In addition , EGF stimulated the expression of p - TOPK ( Y74 ) . 5 . The expression level of endogenous p - TOPK ( Y74 ) was enhanced after 5 , 15 and 30 minutes respectively with EGF - stimulated colon cancer cells SW480 0 , 5 , 15 and 30 minutes .
The expression level of endogenous p - TOPK ( Y74 ) was decreased after 24 h or silent colon cancer cells in colon cancer cells . 6 . After overexpression of TOPK wild - type ( WT ) and single mutation ( 74F ) , the level of endogenous p - TOPK ( Y74 ) decreased .
In the JB6 and SW480 cell lines of 272F ) and double mutation ( FF ) , the cell growth of each mutant group was slower than that in the wild type group ( P0.05 , the difference was statistically significant ) , and the anchoring non - dependent growth capacity of the mutant group cells was lower than that in the wild type group , that is , the capacity of the tumor of the mutant cells decreased . 7 . Compared with the JB6 / WT group , the expression of p - Histone H3 ( S10 ) in the JB6 / FF group was obviously reduced ;
The expression of p - Histone H3 ( S10 ) in SW480 / FF group decreased significantly ( P0.05 ) . The half - life of TOPK in TOPK - FF group was shorter than that of TOPK - WT ;
The stability of TOPK was also lower than that of src + / + MEFs , which indicated that the stability of TOPK was enhanced . Conclusion : In Y74 and Y272 , the activity and stability of TOPK were enhanced , and the occurrence of colon cancer was promoted .

【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.35

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本文編號：1714209