本文選題：孕激素受體M　切入點：原代培養(yǎng)　出處：《鄭州大學》2017年碩士論文

【摘要】：孕激素受體M(mitochondrial progesterone receptor,PR-M)是一種新型的孕激素受體,在2002年由Saner,KJ等發(fā)現(xiàn),其定位于核外線粒體,與傳統(tǒng)孕激素受體PR-A、PR-B相比結(jié)構(gòu)上缺乏N端的A/B結(jié)構(gòu)區(qū)和DNA結(jié)合區(qū),僅有鉸鏈區(qū)和配體結(jié)合區(qū),是截短的新型孕激素受體。PR-M獨特的線粒體定位功能可能是由于其氨基末端的16個氨基酸所組成序列中包含的線粒體定位序列(mitochondrial localization signal,MLS)的存在。目前認為,PR-M可能通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)發(fā)揮其獨特的作用。研究發(fā)現(xiàn)孕激素可以通過劑量依賴性增加原代培養(yǎng)的子宮平滑肌細胞和永生化子宮平滑肌細胞的線粒體膜電位的形式發(fā)揮作用,并且這種反應的發(fā)生可以被孕激素受體拮抗劑抑制。從而說明孕激素可能通過PR-M的非基因組作用增加細胞的能量代謝,而細胞內(nèi)能量的增加使得細胞發(fā)生異常增殖。孕激素可以促使PR-M使線粒體膜電位增加,抑制乳腺癌細胞、原代和永生化子宮平滑肌細胞的凋亡。子宮肌瘤(leiomyoma)是最常見的女性盆腔良性腫瘤,影響30%-50%的育齡期女性,且發(fā)病率呈逐年上升趨勢,是臨床子宮切除術(shù)的主要原因,臨床表現(xiàn)有月經(jīng)異常,不孕,和疼痛等,嚴重影響女性患者的生存質(zhì)量。然而至今其病因病機仍未明確,探討其發(fā)病機制及有效的治療方案一直是國內(nèi)外婦科方面專家研究的熱點。文獻報道基礎(chǔ)和臨床研究均已表明孕激素在子宮平滑肌瘤的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)肌瘤組織中孕激素受體PR-B、PR-A和PR-M的表達均明顯高于它們在子宮肌瘤旁正常子宮平滑肌組織中的表達水平,提示PR-M在肌瘤生長過程中可能發(fā)揮促進作用,孕激素在肌瘤組織中可能通過基因組和非基因組途徑發(fā)揮雙重效應。米非司酮(Mifepristone,RU 486)是一種結(jié)構(gòu)類似類固醇激素的復合物。這種復合物對于孕激素受體和糖皮質(zhì)激素受體具有極強的親和力,并在較小程度上與雄激素受體結(jié)合。它通過不同的信號轉(zhuǎn)導通路,發(fā)揮基因組和非基因組作用。米非司酮最初作為妊娠早期的流產(chǎn)藥物應用,近年來也應用于治療子宮肌瘤等疾病,米非司酮用于治療子宮肌瘤具有效果好,副作用少,復發(fā)率低等優(yōu)勢,但作用機制目前尚不明確。目的在課題組之前的研究基礎(chǔ)上收集肌瘤標本提取原代子宮肌瘤細胞作為研究材料,Western blot檢測孕激素受體的表達并篩選出PR-M陽性細胞株,應用不同濃度梯度的孕激素受體抑制劑RU486干預后,分別應用CCK-8法和流式細胞儀檢測PR-M陽性組和PR-M陰性組子宮肌瘤細胞增殖和凋亡的變化情況,進一步研究PR-M在子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,探討其可能的作用機制,從而深化對PR-M功能作用的理解,給婦產(chǎn)科孕激素相關(guān)疾病的診斷治療提供新的思路和研究方向。材料和方法1研究對象隨機選取2015年9月到2016年6月期間在我院(即鄭州大學第三附屬醫(yī)院)因單純子宮肌瘤行腹腔鏡下全子宮切除術(shù)或腹式肌瘤挖除術(shù)的患者11例,年齡24~48歲,平均(42±4.49)歲。所有患者均不伴隨其他性激素相關(guān)合并癥,且手術(shù)治療前至少半年內(nèi)無類固醇激素應用史。收集的標本均同時經(jīng)過腹腔鏡或開腹手術(shù)診斷、術(shù)后常規(guī)病理檢查證實。所有標本的收集均經(jīng)過患者的知情同意并簽署知情同意書,并經(jīng)本院倫理委員會審核通過。術(shù)中在無菌操作下取大小1-3cm3的肌瘤組織塊數(shù)塊,置于冰盒內(nèi)保存且含雙抗(青鏈霉素混合液)的DMEM-F12(FD)培養(yǎng)液中,盡快運回實驗室進行下一步處理。2試驗方法(1)分離子宮肌瘤組織,提取、培養(yǎng)原代子宮平滑肌瘤細胞,并經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài),免疫細胞化學法(α-SMA單克隆抗體)鑒定確認為子宮平滑肌瘤細胞;(2)應用免疫印跡法(Western Blotting)檢測孕激素受體PR-M、PR-A和PR-B的表達并篩選出PR-M陽性細胞株(即僅表達PR-M,不表達PR-A/B的細胞株)作為研究組,PR-M陰性細胞株(即不表達PR-M,僅表達PR-A/B的細胞株)作為對照組,T-47D乳腺癌細胞株(購自American Type Culture Collection)作為篩選細胞的陽性對照(T47D是經(jīng)文獻證實的同時表達PR-A/B和PR-M的細胞株,因現(xiàn)階段缺乏針對PR-M的特異性抗體,故選擇陽性細胞株用以確認篩選結(jié)果)(3)不同濃度RU-486(空白對照,1×10~(-6)umol/ml,1×10~(-5)umol/ml,1×10~(-4)umol/ml)干預兩組細胞后,利用CCK-8法檢測細胞增殖情況并計算細胞增殖抑制率(加入CCK-8試劑后對各組細胞在波長450nm處的吸光度(A)值進行檢測,每組重復三次,設(shè)置四個復孔。增殖抑制率的計算公式為對照組和實驗組差值與對照組和空白對照組差值的比值。(4)不同濃度RU-486(空白對照,1×10~(-6)mol/L,1×10~(-5)mol/L,1×10~(-4)mol/L)干預兩組細胞,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況并計算細胞凋亡率。結(jié)果1.培養(yǎng)子宮肌瘤細胞11例成功10例,其中1例因細胞量偏少,棄之;成功率91%,與文獻報道接近。子宮肌瘤細胞的鑒定:大部分細胞于接種后24h內(nèi)貼壁并逐漸伸展呈基本規(guī)則的長梭形并緩慢生長,3天左右細胞生長速度加快,一周左右進入對數(shù)期,且密集處多呈旋渦狀,鏡下見典型的“峰-谷”樣現(xiàn)象,應用免疫細胞化學法鑒定為子宮肌瘤細胞(見圖1)。2.Western blot檢測孕激素受體PR-A/B,PR-M在子宮肌瘤細胞中的表達后成功篩選出表達PR-M而不表達PR-A/B的標本作為研究組,且篩選表達PR-A/B不表達PR-M的標本作為陰性對照組。3.RU-486干預后兩組肌瘤細胞增殖的變化:倒置顯微鏡下觀察可以看到,RU-486作用48h后細胞開始變形,且隨著RU-486濃度的不斷增加,兩組細胞的增殖抑制率不斷增加,PR-M陽性組與空白對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(F=8.27,P均0.05);PR-M陰性組與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(F=9.14,P均0.05)。增殖抑制率增加呈現(xiàn)出劑量依賴性(P0.05)。PR-M陽性組的增殖抑制率小于PR-M陰性組,相同濃度作用組間兩兩比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P均0.05)。4.RU-486干預后兩組肌瘤細胞凋亡率的變化:PR-M陽性組與空白對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(F=7.44,P均0.05);PR-M陰性組與空白對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(F=8.32,P均0.05)。隨著藥物濃度的不斷增加,細胞凋亡率均逐漸增加(P0.05)。相同濃度作用組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P均0.05)。結(jié)論1.PR-M在子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展中可能通過抑制子宮肌瘤細胞凋亡,促進肌瘤細胞增殖發(fā)揮重要作用。2.PR-M的作用可能被孕激素受體抑制劑所抑制。
[Abstract]:PR - M is one of the most common female pelvic benign tumors , which affects the survival quality of female patients . The mechanism of PR - M positive control ( PR - M , PR - A / B only ) was examined by Western Blotting . The expression of PR - A / B , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M and PR - M were observed . The proliferation inhibition rate of PR - M positive group was less than that of PR - M negative group , and the difference was statistically significant ( F = 7.44 , P < 0.05 ) . The difference of PR - M negative group and blank control group was significant ( F = 8.32 , P < 0.05 ) . Conclusion 1 . PR - M may play an important role in the development of uterine fibroids . Conclusion 1 . PR - M may play an important role in the development of uterine fibroids .

【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.33

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本文編號：1701059