本文選題：ICC　切入點(diǎn)：ANXA5　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：第一部分ANXA5在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)和意義目的:比較研究 ANXA5(Annexin A5,膜聯(lián)蛋白 A5)在 ICC(intrahepatic cholangio-carcinoma,肝內(nèi)膽管癌)組織中的表達(dá),ANXA5表達(dá)與臨床病例特征之間的關(guān)系,以及ANXA5表達(dá)對(duì)生存率的影響。方法:根據(jù)入選標(biāo)準(zhǔn),選取江蘇省人民醫(yī)院和蘇北人民醫(yī)院2005年6月至2014年6月間共86例肝內(nèi)膽管癌患者,應(yīng)用Western Blotting和免疫組化法檢測(cè)ICC癌組織與相應(yīng)的癌旁組織中ANXA5的表達(dá)情況,用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法研究ICC組織ANXA5表達(dá)情況與患者臨床病例特征的關(guān)系。根據(jù)隨訪結(jié)果,比較ANXA5高表達(dá)對(duì)患者生存率的影響。結(jié)果:ANXA5蛋白在ICC組織中的表達(dá)水平均明顯高于相應(yīng)的癌旁組織,統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異(P0.05)。ANXA5蛋白的表達(dá)高低與ICC腫瘤直徑無(wú)相關(guān)性(P=0.6349);但是與ICC的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無(wú)轉(zhuǎn)移、有無(wú)門靜脈癌栓有關(guān)(P0.05)。ANXA5高表達(dá)組的生存期較低表達(dá)組要短(p0.05)。結(jié)論:ANXA5在ICC中高表達(dá),且表達(dá)的高低與ICC的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、有無(wú)門靜脈癌栓有關(guān)。ICC患者中,ANXA5高表達(dá)者比低表達(dá)者生存期短。第二部分ANXA5-shRNA慢病毒載體構(gòu)建和包裝目的:比較兩種人膽管癌細(xì)胞系QBC939和RBE中的ANXA5的表達(dá)情況,選擇ANXA5表達(dá)高的QBC939細(xì)胞進(jìn)入RNAi實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建ANXA5-shRNA慢病毒載體,和其他輔助包裝質(zhì)粒一起共同轉(zhuǎn)導(dǎo)入293T細(xì)胞,包裝后形成LV-ANXA5-RNAi慢病毒,轉(zhuǎn)染QBC939細(xì)胞用于基因敲減ANXA5的表達(dá)。方法:針對(duì)ANXA5-mRNA的不同位點(diǎn)人工設(shè)計(jì)3條寡核苷酸鏈,以GV248慢病毒載體,構(gòu)建psc16759-1,psc16760-1,psc16761-1三種質(zhì)粒,再感染293T細(xì)胞(慢病毒包裝細(xì)胞),得到三種 LVpsc16759-1,LVpsc16760-1,LVpsc16761-1三種病毒。三種病毒再感染QBC939細(xì)胞,經(jīng)過(guò)qPCR檢測(cè),篩選出符合要求的病毒。結(jié)果:得到了三種RNA干擾病毒,分別為L(zhǎng)Vpsc16759-1,LVpsc16760-1,LVpsc 16761-1,經(jīng)過(guò)qPCR檢測(cè),ANXA5的基因敲減率分別為89.2%、77.1%、32.9%。LVpsc16759-1病毒對(duì)ANXA5基因敲減效率達(dá)到89.2%,可以用于后續(xù)的細(xì)胞功能學(xué)研究。結(jié)論:ANXA5-shRNA慢病毒載體構(gòu)建成功,LVpsc16759-1慢病毒轉(zhuǎn)染QBC939細(xì)胞基因敲減效率高,可用于下一步實(shí)驗(yàn)。第三部分ANXA5-shRNA對(duì)QBC939細(xì)胞的體外抑制作用目的:通過(guò)ANXA5-shRNA的干擾,使QBC939細(xì)胞ANXA5蛋白表達(dá)下調(diào),探討其干擾后對(duì)QBC939細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。方法:采用MTT法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組QBC939細(xì)胞的增殖情況;用流式細(xì)胞儀檢查QBC939-ANXA5-shRNA的凋亡情況;用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞的隨意運(yùn)動(dòng)能力變化;用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穿膜侵襲能力。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組QBC939細(xì)胞增殖明顯較對(duì)照組減慢(p0.05),干擾前后細(xì)胞凋亡明顯增加(p0.05),干擾后的QBC939遷移能力明顯下降(p0.05),其穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)量也明顯減少(p0.05)。結(jié)論:ANXA5-shRNA轉(zhuǎn)染后不僅抑制QBC939細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)QBC939細(xì)胞的凋亡,還可以抑制QBC939細(xì)胞的侵襲能力,可為以后的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:The expression of ANXA5 and ANXA5 in the tissues of intrahepatic cholangiocarcinoma were studied by Western Blotting and immunohistochemistry . The effects of ANXA5 - shRNA on the proliferation of QBC939 cells were investigated by MTT assay .

【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1690607