本文選題：鄰苯二甲酸-單-2-乙基己酯　切入點：四氯二苯并-對-二VA英　出處：《天津醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：目的:本研究旨在探討鄰苯二甲酸-單-2-乙基己酯(Mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP)暴露、四氯二苯并-對-二VA英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)暴露、MEHP與TCDD共暴露對乳腺癌細胞MCF-7的增殖、遷移和侵襲,以及對芳香烴受體(Aryl hydrocarbon receptor,AhR)信號通路的影響,以闡明MEHP與TCDD共暴露在乳腺癌發(fā)展過程中的作用及機制。方法:1.通過MTS檢測0.1μM~100μM的MEHP單獨暴露,1nM的TCDD單獨暴露,以及MEHP與TCDD共暴露6h、12h、24h、48h,對細胞增殖的影響,采用siRNA技術干擾AhR的表達后再次分析MEHP和TCDD暴露6h和48h對細胞增殖的影響。2.采用Transwell檢測1~100μM的MEHP單獨暴露,1nM的TCDD單獨暴露,以及MEHP與TCDD共暴露24h和48h,對MCF-7細胞遷移和細胞侵襲的影響,并在siRNA干擾AhR后再次檢測MEHP和TCDD暴露48h對細胞遷移和侵襲。3.采用PCR-Array方法篩選100μM的MEHP單獨暴露,100nM的TCDD單獨暴露,以及MEHP與TCDD共暴露24h對腫瘤發(fā)展相關基因的影響。4.采用qRT-PCR實驗,Western blotting實驗檢測1μM~100μM的MEHP單獨暴露、1nM的TCDD單獨暴露、MEHP與TCDD共暴露24h對AhR、CYP1A1和CYP1B1基因和蛋白表達的影響;采用P450-Glo?Assays實驗檢測1μM~100μM的MEHP單獨暴露、1nM的TCDD單獨暴露、MEHP與TCDD共暴露48h對CYP1A1和CYP1B1活性的影響;采用染色質免疫共沉淀實驗探討100μM的MEHP單獨暴露、1nM和100nM的TCDD單獨暴露以及MEHP與TCDD共暴露對AhR與二VA英反應原件(Dioxin-responsive element,DRE)結合的影響。結果:1.MEHP暴露6h和48h均可抑制細胞增殖,具體表現(xiàn)為MEHP 10μM、20μM和40μM暴露6h后可顯著抑制細胞增殖(所有P0.001),MEHP 1μM、10μM和20μm暴露48h可顯著抑制細胞增殖(p值分別為0.036,0.009和0.026),其他濃度暴露不影響細胞增殖;轉染sirna-ahr后并不能緩解mehp對細胞增殖的抑制作用,表明mehp抑制增殖作用不依賴ahr;2.tcdd單獨暴露不影響細胞增殖(p值分別為0.208,0.875,0.474和0.751)。mehp與tcdd共暴露6h和48h對細胞增殖的影響存在交互作用(p值分別為0.013和0.011),而共暴露12h和24h對細胞增殖無影響。mehp與tcdd共暴露后,細胞增殖能力顯著降低,表明mehp與tcdd共暴露可抑制細胞增殖;ahr干擾后并未緩解mehp與tcdd共暴露對細胞增殖的抑制作用,表明共暴露對細胞增殖的影響不依賴ahr;3.mehp暴露可促進細胞遷移和侵襲,表現(xiàn)為mehp1μm、10μm和100μm暴露24h均可顯著促進細胞遷移(所有p≤0.001),mehp10μm和100μm暴露48h后細胞遷移能力顯著高于對照組(所有p0.001),mehp10μm和100μm暴露48h后細胞侵襲能力顯著高于mehp1μm(p值分別為0.028和0.003);轉染sirna-ahr后mehp100μm誘導的細胞遷移作用減弱(p=0.010),但是轉染sirna-ahr不影響mehp100μm介導的細胞侵襲(p=0.416),表明mehp介導的細胞遷移依賴ahr,而mehp介導的細胞侵襲不依賴ahr;qrt-pcr結果表明,mehp暴露可增加mmp2,mmp9,vimentin的mrna水平,降低e-cadherin水平(p值分別為0.025,0.003,0.003和0.002);sirna干擾ahr后可抑制mehp介導的mmp2基因表達(p=0.044)。4.1nm的tcdd暴露24h和48h均可顯著促進細胞遷移(所有p≤0.001);在細胞遷移上,mehp與tcdd之間存在拮抗性交互作用(p=0.001),而在細胞侵襲上無影響(p=0.056);sirna干擾ahr后可顯著抑制tcdd暴露誘導的細胞遷移(p=0.001);sirna干擾ahr后,tcdd單獨暴露組mmp2、mmp9基因表達水平均顯著降低(p值分別為0.032和0.043),表明tcdd介導的mmp2和mmp9表達依賴ahr。5.pcr-array結果表明,mehp暴露可顯著上調23個基因表達,下調8個基因表達;tcdd暴露可顯著上調22個基因表達,下調6個基因表達。在18個基因表達上,mehp可產生與tcdd相同的作用,包括14個上調的基因和4個下調的基因。在mmp14,pai1,plau,gpx1,pou5f1,cxcr4,jup,dll4和cyp1a1等9個基因上mehp與tcdd之間存在拮抗作用,在il1b,cdh5,nfe2l2,mtor和mapk14上mehp與tcdd共暴露存在協(xié)同作用。6.MEHP暴露6h、12h、24h和48h均可顯著增加AhR的表達,同時顯著增加CYP1A1和CYP1B1的表達,且AhR,CYP1A1,CYP1B1的mRNA水平隨MEHP濃度增加而增加(所有P≤0.001),隨暴露時間延長而增加(所有P≤0.001)。轉染siRNA-AhR后,MEHP誘導的CYP1A1與轉染siRNA-NC相比下降39.91%,CYP1B1下降43.28%;染色質免疫共沉淀結果表明,MEHP暴露2h即可增加AhR與CYP1A1和CYP1B1調節(jié)區(qū)域的DRE結合,Luciferase報告基因結果顯示MEHP可顯著上調CYP1A1的啟動子活性,證明MEHP可通過上調AhR的表達,并增加AhR的轉錄活性,進而誘導CYP1A1和CYP1B1的表達;7.MEHP與TCDD共暴露對AhR和CYP1A1基因表達存在拮抗性交互作用(P值分別為0.009和0.041),MEHP介導的AhR基因表達被TCDD抑制,同時TCDD介導的CYP1A1基因表達可被MEHP抑制;MEHP與TCDD共暴露對CYP1B1的表達交互作用無統(tǒng)計學意義(P=0.586);轉染siRNA-Ah R后,TCDD誘導的CYP1A1顯著降低,且MEHP對TCDD介導的CYP1A1表達的拮抗作用消失,表明TCDD與MEHP共暴露在CYP1A1的表達過程中的拮抗作用依賴AhR;染色質免疫共沉淀結果表明,MEHP可拮抗性降低AhR與CYP1A1啟動子區(qū)域的DRE結合,由此拮抗TCDD介導的CYP1A1的表達。結論:1.MEHP具有AhR活性,可上調AhR的表達和轉錄活性,是MEHP促進MCF-7細胞遷移的作用機制之一。2.MEHP與TCDD共暴露可拮抗TCDD介導的AhR與DRE的結合,從而拮抗TCDD介導的CYP1A1的表達。3.MEHP與TCDD在MMP14,PAI1,PLAU,GPX1,POU5F1,CXCR4,JUP,DLL4的表達上具有拮抗作用,在IL1B,CDH5,NFE2L2,MTOR和MAPK14等5個基因表達上具有協(xié)同作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：1684590