本文選題：人巨細胞病毒　切入點：膠質(zhì)瘤干細胞　出處：《青島大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:1.探討不同感染復(fù)數(shù)(MOI)的人巨細胞病毒(HCMV)在體外對U251膠質(zhì)瘤干細胞(GSCS)增殖、分化及凋亡的影響。2.用MOI為1的HCMV AD169毒株感染U251GSCS,觀察HCMV對U251GSCS在裸鼠大腦內(nèi)成瘤及血管生成的影響。方法:1.用HCMV AD169毒株感染人胚肺成纖維細胞進行病毒擴增,收集上清并用空斑定量法檢測病毒滴度。2.用單克隆培養(yǎng)法從U251膠質(zhì)瘤細胞中分離出GSCS,用流式細胞儀檢測U251GSCS中表達CD133的細胞數(shù)。3.用MOI分別為0.2、1、5的HCMV感染U251GSCS。分別在感染后12h、24h、36h、48h時間點,用MTT法檢測U251GSCS增殖情況。4.在HCMV感染后48h,用RT-PCR檢測U251GSCS中IE-1 m RNA、Bcl-2 m RNA及Bax m RNA的表達。用Western blot檢測U251GSCS中IE-1、Bcl-2、Bax和CD133蛋白的表達。5.將MOI為1的HCMV感染U251GSCS,然后接種到10只裸鼠顱內(nèi),設(shè)為實驗組;對照組接種未感染HCMV的U251GSCS。觀察裸鼠生長情況及外觀變化。6.處死瀕死裸鼠,取出腦組織并分理出腫瘤組織做HE染色。用免疫組化法檢測腫瘤組織中IE-1、CD34蛋白的表達。7.采用weidner血管計數(shù)法計算出實驗組和對照組腫瘤微血管密度(MVD)。結(jié)果:1.U251膠質(zhì)瘤細胞在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長。流式細胞儀結(jié)果顯示,U251GSCS中CD133陽性細胞比例達98.00%。2.MTT結(jié)果顯示,用MOI為1和5的HCMV感染U251GSCS 12h、24h、36h、48h后,與對照組相比,細胞增殖活性顯著增加(P0.05)。而用MOI為0.2的HCMV感染U251GSCS12h、24h、36h、48h后,與對照組比較,細胞增殖活性差異不明顯(P0.05)。3.RT-PCR結(jié)果顯示,HCMV(MOI=1,5)感染U251GSCS 48h后,細胞IE-1 m RNA、Bcl-2 m RNA的表達上調(diào),Bax m RNA表達下調(diào),與對照組比較,差異顯著(P0.05)。而用MOI為0.2的HCMV感染U251GSCS 48h后,細胞IE-1 m RNA、Bcl-2m RNA及Bax m RNA表達與對照組相比無明顯差異(P0.05)。4.Western blot檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,HCMV(MOI=1,5)感染U251GSCS48h后,細胞IE-1、Bcl-2及CD133蛋白表達增多,而Bax蛋白表達下降(P0.05)。5.接種感染HCMV(MOI=1)的U251GSCS3周后,大部分裸鼠出現(xiàn)活動減少、皮膚皺縮和一些神經(jīng)癥狀。6.移植瘤HE染色顯示,腫瘤細胞核異形明顯。免疫組化結(jié)果顯示,與對照組相比,HCMV(MOI=1)感染的U251GSCS移植瘤IE-1表達陽性。7.weidner血管計數(shù)結(jié)果顯示,HCMV(MOI=1)感染的U251GSCS移植瘤微血管密度顯著高于對照組(P0.05)。結(jié)論:1.一定滴度的HCMV感染U251GSCS可促進其增殖,使其維持干性特征。2.HCMV感染U251GSCS后,細胞表達IE-1并通過下調(diào)Bax蛋白的表達和上調(diào)Bcl-2蛋白的表達來抑制U251GSCS凋亡。3.HCMV感染可通過促進CD133陽性U251GSCS分化為CD34血管內(nèi)皮細胞來促進U251GSCS移植瘤的生長,從而增加其惡性程度。
[Abstract]:Objective: 1. To investigate the proliferation of human cytomegalovirus (HCMV), a human cytomegalovirus virus (HCMV) infected with multiple moi, on U251 glioma stem cells (GSCS) in vitro. Effect of differentiation and apoptosis. U251GSCS was infected with HCMV AD169 strain with MOI 1 to observe the effect of HCMV on U251GSCS tumorigenesis and angiogenesis in the brain of nude mice. Methods: 1. Human embryonic lung fibroblasts were infected with HCMV AD169 strain for virus amplification. GSCSs were isolated from U251 glioma cells by monoclonal culture method, and the number of cells expressing CD133 in U251GSCS was detected by flow cytometry. The U251G SCSs were infected with HCMV with MOI of 0.2GSCS0.The cells were infected with U251GSCSs at 12h, 24h, 36hs, 48h after infection, respectively, and the results showed that GSCSs were isolated from U251 glioma cells by Monoclonal culture, and the cells expressing CD133 in U251 glioma cells were detected by flow cytometry. The proliferation of U251GSCS was detected by MTT. At 48h after HCMV infection, the expression of IE-1 m RNA-Bcl-2 m RNA and Bax m RNA in U251GSCS was detected by RT-PCR, and the expression of IE-1bcl-2Bcl-2Bax and CD133 protein in U251GSCS was detected by Western blot. The MOI was infected with U251GSCSand then inoculated into 10 nude mice. The control group was inoculated with U251 GSCS. the growth and appearance changes of nude mice were observed. Take out brain tissue and divide it into tumor tissue for HE staining. Immunohistochemical method was used to detect the expression of IE-1pCD34 protein in tumor tissue .7.The microvessel density of tumor in experimental group and control group was calculated by weidner vessel count method. Results: 1. U251 glioma. The percentage of CD133 positive cells in U251 GSCS was higher than that in 98.00%.2.MTT. Compared with the control group, the proliferation activity of the cells infected with 1 and 5 HCMV (1 and 5 HCMV) increased significantly compared with the control group for 48 h, and the proliferation activity of the cells infected with U251 GSCS 12 h and 24 h HCMV with MOI 0. 2 was not significantly different from that of the control group (P 0 05. 3. RT-PCR results showed that the cell proliferation activity was not significantly different from that of the control group (P 0. 05. 3. RT-PCR results showed that the cells were infected with U251GSCS 48 h after infection with MOI 0. 2 GSCS 12 h or 24 h ~ 12 h) and the results of RT-PCR showed that there was no significant difference in cell proliferation activity between the control group and the control group. The expression of Bcl-2 m RNA in IE-1 m RNAs up-regulated the expression of Bax m RNA, and the difference was significant compared with the control group. However, the expression of IE-1 m RNAs Bcl-2m RNA and Bax m RNA was not significantly different from that of the control group after the U251GSCS was infected with MOI 0.2 for 48 h. The results of Western blot analysis showed that the expression of Bcl-2m RNA and Bax m RNA in the cells were not significantly different from those in the control group. Compared with the control group, the expression of IE-1Bcl 2 and CD133 protein increased after U251GSCS48h infection, while the expression of Bax protein decreased (P0.05. 5). After inoculation with HCMV / MOI1), the activity of most nude mice was decreased, skin shrinkage and some neurologic symptoms. The nuclei of the tumor were abnormal. The immunohistochemical results showed that, Compared with the control group, the microvessel density of U251GSCS transplanted tumor infected with HCMV / moi 1) was significantly higher than that of the control group (P 0.05). Conclusion: 1. A certain titer of HCMV infection with U251GSCS can promote the proliferation of U251GSCS transplant tumor. 7. Weidner blood vessel count showed that the microvessel density of U251GSCS transplanted tumor infected with HCMV was significantly higher than that of the control group (P 0.05). Conclusion: 1. A certain titer of HCMV infection with U251GSCS can promote the proliferation of U251GSCS transplant tumor. After HCMV was infected with U251GSCS, The cells expressed IE-1 and down-regulated the expression of Bax protein and up-regulated the expression of Bcl-2 protein to inhibit U251GSCS apoptosis. 3. HCMV infection could promote the growth of U251GSCS transplanted tumor by promoting the differentiation of CD133 positive U251GSCS into CD34 vascular endothelial cells, thus increasing the malignant degree of U251GSCS transplanted tumor.
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R739.41

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本文編號：1676022