本文選題：腫瘤干細胞　切入點：結(jié)直腸癌　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：背景:結(jié)直腸癌是最常見的消化道腫瘤之一。在我國,隨著生活方式、飲食結(jié)構(gòu)改變、人口老齡化等諸多因素影響,結(jié)直腸癌發(fā)病率近年來呈明顯的上升趨勢,防治形勢仍十分嚴(yán)峻。而腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其死亡的主要原因。腫瘤干細胞因其自我更新、無限增殖潛能、獨特的耐藥機制等特性被認為是腫瘤產(chǎn)生和發(fā)展的元兇。而上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腫瘤向外侵襲和轉(zhuǎn)移的重要方式。近幾年研究發(fā)現(xiàn),腫瘤干細胞與EMT關(guān)系密切。在實驗?zāi)Ｐ椭?EMT使腫瘤細胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移表型、耐受藥物攻擊并具有腫瘤干細胞表型。發(fā)生EMT的細胞上皮相關(guān)蛋白如E-鈣黏蛋白降低,而間質(zhì)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Snail、Twist及相關(guān)蛋白波形蛋白、纖連蛋白等則升高。腫瘤細胞通過EMT,其黏附力減弱,運動性增強,可向遠端侵襲及轉(zhuǎn)移。通過藥物誘導(dǎo)或高表達EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子可使細胞發(fā)生EMT改變,而這些細胞可表現(xiàn)出腫瘤干細胞的特點;另一方面,富集的腫瘤干細胞具備EMT細胞的表型和特點。因此,EMT被認為是腫瘤干細胞的特性之一,通過EMT腫瘤干細胞可實現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移。然而,由于EMT是一個快速的轉(zhuǎn)化過程,目前所觀察到的結(jié)果多是從體外實驗或動物模型中獲得,真實腫瘤中發(fā)生的EMT及其在腫瘤中的作用仍有待證實。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展除了細胞具備自身增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移所需要的特性外,還必須能躲避機體的免疫監(jiān)視機制才能最終生存,而目前關(guān)于腫瘤干細胞的免疫逃逸機制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫逃逸與EMT有關(guān),通過誘導(dǎo)EMT而形成的腫瘤中伴隨大量調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的浸潤和樹突狀細胞(DC)的功能受損。綜上分析,推測腫瘤免疫逃逸對于發(fā)生EMT侵襲、轉(zhuǎn)移的腫瘤干細胞躲避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視、清除并最終形成腫瘤具有重要的意義。B7H1是重要的起負向調(diào)控作用的共刺激因子,是程序性死亡受體PD-1的配體。腫瘤細胞高表達的B7H1可與淋巴細胞上PD-1結(jié)合而使淋巴細胞失能,從而促進腫瘤細胞的免疫逃逸。然而,B7H1在結(jié)直腸癌干細胞中的表達及其與EMT的關(guān)系并不清楚。因此,在本課題中,擬通過CD133分子對結(jié)直腸癌干細胞進行分選鑒定,并對其在腫瘤組織中的分布特點及其EMT表型與B7H1的表達特點進行檢測,了解腫瘤干細胞免疫逃逸的可能機制及其與emt的關(guān)系。此外,通過ifn-γ上調(diào)b7h1表達進一步檢測b7h1表達變化對不同腫瘤細胞亞群干細胞相關(guān)表型和功能的影響。方法:(1)在結(jié)腸癌細胞株ht29中以cd133分子為標(biāo)記,通過磁珠分選得到不同的cd133+、cd133-細胞亞群,比較兩群細胞在nod/scid小鼠中的成瘤能力、無血清培養(yǎng)基中的成球能力有無差別。此外,通過q-pcr的方法檢測兩群細胞其他干性相關(guān)分子oct-4、sox-2的表達情況,并檢測emt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子twist、snail及相關(guān)蛋白e-鈣黏蛋白、波形蛋白、纖連蛋白的表達情況,以檢測分選到的cd133+細胞是否同時高表達其他干性分子并具有emt的表達特點。(2)收集結(jié)直腸癌手術(shù)標(biāo)本,制備冰凍切片。通過免疫熒光染色檢測結(jié)直腸癌組織中cd133在各期腫瘤中的分布情況,epcam分子用于區(qū)分腫瘤細胞及間質(zhì)細胞。此外,通過cd133分子與e-鈣黏蛋白、波形蛋白在同一切片中染色,并用激光共聚焦顯微鏡同時觀察幾個分子的表達情況,以檢測cd133+細胞的emt表型。(3)通過免疫熒光染色檢測ht29細胞及結(jié)直腸癌組織中b7h1與cd133的表達情況,分析b7h1在各期腫瘤中的表達特點。此外,檢測b7h1陽性細胞中e-鈣黏蛋白、波形蛋白的表達情況。(4)通過在培養(yǎng)體系中加入ifn-γ上調(diào)b7h1表達,檢測ht29細胞cd133表達及emt表型的變化,并檢測不同cd133+、cd133-細胞亞群成瘤能力的改變,分析細胞因子作用上調(diào)b7h1表達后對腫瘤干樣細胞干性表型及功能的影響。研究結(jié)果:(1)通過優(yōu)化的磁珠分選方法,分選得到相應(yīng)的cd133+、cd133-細胞亞群,細胞純度在80%以上。cd133+細胞與cd133-細胞相比,在nod/scid小鼠體內(nèi)成瘤能力、無血清培養(yǎng)基中成球能力均顯著增強,且高表達干性因子oct-4及sox-2,高表達emt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子snail、twist,間質(zhì)細胞相關(guān)標(biāo)志波形蛋白、纖連蛋白,而低表達上皮細胞相關(guān)標(biāo)志e-鈣黏蛋白。分選得到的cd133+ht29細胞具有干細胞相關(guān)的表型和特點,并且相關(guān)基因的表達符合emt相關(guān)改變。(2)在結(jié)直腸癌組織中,伴隨組織tnm分期的增加,cd133總體表達水平呈上升趨勢。cd133表達于epcam+的腫瘤細胞上;此外,部分cd133+腫瘤細胞e-鈣黏蛋白表達降低而出現(xiàn)波形蛋白表達,呈現(xiàn)emt的表型改變。(3)在ht29細胞及結(jié)直腸癌組織中,b7h1與cd133分子存在共表達的情況。B7H1分子在腫瘤組織中的表達比較復(fù)雜,收集的20例組織中,其中13例主要表達于腫瘤細胞上,該部分組織中B7H1與CD133的共表達現(xiàn)象普遍,且部分B7H1+細胞具有EMT的表型特點。而有6例組織中B7H1主要在間質(zhì)細胞上表達,其中部分為CD3+T細胞。(4)IFN-γ作用后HT29細胞B7H1表達增加,細胞呈現(xiàn)梭形的EMT特征,但CD133表達陽性率下降。進一步用IFN-γ作用于不同的CD133+及CD133-細胞亞群,發(fā)現(xiàn)處理后CD133+細胞的成瘤能力沒有降低,但CD133-細胞亞群的成瘤能力則顯著增高。通過檢測IFNg R1、IFNg R2,發(fā)現(xiàn)IFN-γ作用后其受體mRNA水平在兩亞群細胞中均增高,其中IFNg R1的增高有顯著差異。此外,PCNA在作用后兩群細胞中增高明顯,提示了IFN-γ作用后可能增強了CD133-細胞亞群的增殖能力,使其在小鼠體內(nèi)腫瘤生長速度較快。結(jié)論:(1)以CD133為標(biāo)志分選到腫瘤細胞具有腫瘤干細胞的特點。(2)CD133在結(jié)直腸癌中的表達與腫瘤TNM分期有關(guān),部分CD133+細胞具有EMT表型特點。(3)B7H1與CD133存在共表達情況且部分B7H1+細胞具有EMT表型特點,推測上調(diào)B7H1可能是腫瘤干細胞免疫逃逸的機制之一。(4)IFN-γ作用后腫瘤細胞B7H1上調(diào)表達并發(fā)生EMT形態(tài)改變而CD133表達則下降。IFN-γ短期處理后沒有降低CD133+細胞的成瘤能力,但CD133-細胞成瘤能力明顯增強,提示細胞因子作用可以改變不同亞群細胞的干性表型及功能,并有可能使非腫瘤干細胞向干細胞方向轉(zhuǎn)化。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34

【參考文獻】

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本文編號：1675033