本文選題：食管鱗狀細胞癌　切入點：侵襲轉移　出處：《新疆醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：目的:1)建立不同侵襲轉移潛能人食管鱗癌細胞亞系,用基因芯片篩選差異基因,建立食管鱗癌侵襲轉移相關基因表達譜;2)驗證部分差異基因在不同侵襲轉移潛能食管鱗癌細胞和組織的表達,探討HSP90α、Annexin A1和14-3-3β在新疆哈薩克族食管鱗癌的表達和病理意義;3)研究HSP90AA1沉默對食管鱗癌細胞生物學行為的影響和機制。方法:1)采用Transwell侵襲小室對Eca109母系(Eca109-T0)進行篩選,建立高侵襲轉移潛能食管鱗癌細胞亞系Eca109-T4;體、內外比較Eca109-T0、Eca109-T4、CE81T-0和CE81T-4各系ESCC遷移和增殖能力;以Eca109-T0和Eca109-T4為對象,提取總RNA,分別用Cy5和Cy3熒光標記成cDNA探針,與基因芯片Affymetrix Gene Chip?Human Genome U133 Plus 2.0 Arry雜交,篩選出不同侵襲轉移潛能食管鱗癌差異表達基因;對差異基因進行GO和KEGG聚類分析;2)采用qRT-PCR、Western blot和免疫組化驗證部分差異基因表達;在細胞水平驗證基因(HSP90AA1、ANXA1、YWHAB、CXCR7、SDC2和TNFRSF10DmRNA)和蛋白(HSP90α、AnnexinA1、14-3-3β和CXCR7)表達差異:采用免疫組化驗證蛋白(HSP90α、AnnexinA1和14-3-3β)在86對新疆哈薩克族食管鱗癌和癌旁組織中的表達,分析各蛋白表達水平與浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移、性別、年齡、大體類型、腫瘤位置和大小等臨床病理參數的相關性;3)采用RNAi干擾技術下調CE81T-4細胞中HSP90AA1的表達,綠色熒光、qRT-PCR及Western blot檢測轉染效果,MTT法檢測CE81T-4細胞的增殖;流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡;劃痕愈合實驗、Transwell侵襲實驗檢測細胞遷移、侵襲能力;Western blot檢測MET、MMP2、ERK和P-ERK蛋白的表達變化;qRT-PCR檢測MET和MMP2mRNA表達差異;復制裸鼠皮下移植瘤模型,觀察移植瘤增殖速度和瘤體重量。結果:1)Transwell小室篩選出Eca109-T4高侵襲轉移潛能人食管鱗癌細胞亞系,體內外生物學特性比較結果:Eca109-T4、CE81T-4的增殖、遷移及體外成瘤能力均高于Eca109-T0和CE81T-0;Eca109-T4的遷移、浸潤能力高于CE81T-4組;對Eca109-T0和Eca109-T4基因芯片檢測,共篩選出326個差異基因,其中Eca109-T4組上調123個,與Eca109-T0比較下調表達203個;GO聚類分析顯示差異基因主要定位在細胞質、細胞核和細胞液;分子功能涉及蛋白結合,金屬離子結合和DNA結合等;參與細胞信號轉導、轉錄、細胞凋亡、細胞增殖、細胞黏附等生物學過程;KEGG聚類分析顯示差異基因主要參與肌動蛋白細胞骨架調節(jié)、mapk通路和癌癥通路等信號轉導途徑;2)驗證結果與基因芯片篩選結果基本一致,qrt-pcr檢測:hsp90aa1、ywhab、cxcr7和sdc2mrna在eca109-t4、ce81t-4的表達高于在eca109-t0、ce81t-0的表達(p0.05);tnfrsf10dmrna在ce81t-4組低于在eca109-t4的表達(p0.05);annexina1在eca109-t0、ce81t-0的表達高于在eca109-t4、ce81t-4表達(p0.05);westernblot結果:hsp90α、14-3-3β、cxcr7蛋白在eca109-t0和ce81t-0低于在eca109-t4和ce81t-4的表達(p0.05),annexina1蛋白在eca109-t0、ce81t-0的表達高于在eca109-t4和ce81t-4的表達(p0.05);hsp90aa1mrna和hsp90α蛋白在ce81t-4表達高于在eca109-t4的表達(p0.05);免疫組化結果:hsp90α、14-3-3β在新疆哈薩克族食管鱗癌組織中陽性表達率高于在癌旁組織的表達(87.2%㤘18.6%,80.23%㤘41.86%,p=0.000,0.0002),annexina1在食管鱗癌組織的表達低于在癌旁組織表達(32.6%㤘59.3%,p=0.0002);hsp90α與腫瘤浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移相關(p=0.024、0.021、0.011),與患者性別、年齡、類型、位置和腫瘤大小無關(p0.05);annexina1與分化程度和淋巴結轉移相關(p=0.037、0.014),與浸潤深度、年齡、性別、類型、腫瘤大小和位置等其他病理參數無關(p0.05);14-3-3β表達與浸潤深度和分化程度有關(p=0.008、0.035),與年齡、性別、淋巴結轉移、類型、位置和腫瘤大小無關(p0.05);3)hsp90aa1-rnai干擾ce81t-4細胞后可見到綠色熒光,hsp90aa1mrna和hsp90α蛋白在實驗組(hsp90aa1-rnai)的表達低于陰性組對照組(nc-rnai)和正常培養(yǎng)組(nc)(p0.05),證實有效下調hsp90aa1表達;mtt檢測0h和24h兩個時間點各組無差異(p0.05),在48h、72h和96hhsp90aa1-rnai組細胞增殖被抑制(p0.05);hsp90aa1-rnai組細胞周期阻滯于g0/g1期,hsp90aa1下調誘導細胞凋亡,凋亡率在hsp90aa1-rnai、nc-rnai和nc組分別為(27.30±4.33)%、(5.63±1.12)%、(10.20±2.04)%(p0.05);劃痕后24h、48h和72h各時間點hsp90aa1-rnai組細胞的遷移距離減小(p0.05);transwell侵襲實驗結果:hsp90aa1-rnai組侵襲細胞數目降低(p0.05);westernblot檢測hsp90aa1-rnai組的met、mmp2和p-erk蛋白表達降低(p0.05),erk在各組表達無差異(p0.05);qrt-pcr檢測met、mmp2mrna在hsp90aa1-rnai組表達降低(p0.05);hsp90aa1-rnai組皮下移植瘤增殖速度慢,重量低(p0.05)。結論:1)建立的不同侵襲轉移潛能食管鱗癌細胞株模型,為后續(xù)研究提供了模型;侵襲轉移差異基因表達譜的建立和生物信息學分析為深入轉移相關研究提供了豐富的信息;2)hsp90aa1、anxa1、ywhab、cxcr7和sdc2與食管鱗癌侵襲轉移有關;hsp90α、14-3-3β在食管鱗癌高表達,它們與浸潤深度呈正相關,與分化程度呈負相關;hsp90α和淋巴結轉移呈正相關;annexina1在食管鱗癌中低表達,在分化程度高的,無淋巴結轉移的食管鱗癌中Annexin A1表達上調;HSP90α、Annexin A1及14-3-3β的表達可一定程度反映食管鱗癌的分化程度、侵襲深度和有無淋巴結轉移,有望成為食管鱗癌早期診斷,預測轉移,侵襲和分化程度的分子標志物;2)RNAi技術可有效抑制CE81T-4細胞中靶基因HSP90AA1表達,HSP90AA1下調表達使CE81T-4細胞周期阻滯于G0/G1期,促進凋亡,抑制增殖、侵襲和遷移能力,可能通過下調P-ERK、MET和MMP2機制介導的。
[Abstract]:Objective : To investigate the expression of HSP90AA1 ( HSP90偽 , AnnexinA1 and 14 - 3 - 3尾 ) in esophageal squamous cell carcinoma of Xinjiang , and to investigate the expression of HSP90偽 , AnnexinA1 and 14 - 3 - 3尾in esophageal squamous cell carcinoma of Xinjiang . The expression of HSP90AA1 in CE81T - 4 cells was regulated by using RNAi interference technique . The results showed that the expression of HSP90AA1 in CE81T - 4 cells was lower than that of CE81T - 4 . The results showed that the expression of Eca109 - T4 , CE81T - 4 was higher than that of CE81T - 4 . The expression of annexina1 in eca109 - t0 and ce81t - 0 was higher than that in eca109 - t4 and ce81t - 4 ( p0.05 ) ; the expression of annexina1 in eca109 - t0 and ce81t - 0 was higher than that in eca109 - t4 and ce81t - 4 ( p0.05 ) ; the expression of annexina1 in eca109 - t0 and ce81t - 0 was higher than that in eca109 - t4 and ce81t - 4 ( p0.05 ) ; It may be mediated by downregulating the P - ERK , MET , and MMP2 mechanisms .

【學位授予單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.1
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本文編號：1674632