本文選題：前列腺癌　切入點(diǎn)：激素依賴性前列腺癌(ADPC)　出處：《東南大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。在北美地區(qū)男性惡性腫瘤當(dāng)中,前列腺癌的發(fā)病率最高并且死亡率僅次于肺癌。在我國,隨著人口老齡化的加劇,生活方式的西化,前列腺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢,已成為威脅我國男性健康的主要疾病之一。前列腺癌的具體病因尚不完全清楚。普遍認(rèn)為前列腺癌的形成是一個(gè)多因素多階段的過程。目前,前列腺癌根治性切除術(shù)是治療局限性前列腺癌的主要手段,但是對于已發(fā)生轉(zhuǎn)移或者術(shù)后復(fù)發(fā)的患者,通常采用內(nèi)分泌治療。研究表明,80%患者早期對雄激素剝奪治療敏感,但是在18-30個(gè)月的中位時(shí)間后,幾乎所有患者的病變都將逐漸發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)。這一階段的患者對于內(nèi)分泌治療以及放化療均不敏感,病情變得難以控制并且更容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,進(jìn)入了難以治愈的階段,已成為晚期前列腺癌患者主要的死亡原因。因此,探討前列腺癌的進(jìn)展機(jī)制以及尋找新的分子生物治療靶點(diǎn),對于延緩前列腺癌的惡性進(jìn)展以及提高晚期腫瘤患者的生存率具有重要意義。近年來,microRNA (miRNA)在腫瘤中起到的作用受到了越來越多的關(guān)注。miRNA是一種單鏈的非編碼小分子RNA,由長度19-25個(gè)核苷酸構(gòu)成。不同物種間的miRNA具有高度保守性,是調(diào)控基因表達(dá)的重要分子。成熟的miRNA通過堿基互補(bǔ)配對的方式與編碼基因的mRNA3'非編碼區(qū)(3'UTR),通過抑制轉(zhuǎn)錄起始或者降解mRNA的途徑,在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)。至今為止,已發(fā)現(xiàn)的miRNA有數(shù)種,調(diào)控了人類基因組中大約一半的編碼基因,并且miRNA的表達(dá)水平異常或功能紊亂密切影響了細(xì)胞的增殖、分化和凋亡以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。目前,越來越多的研究表明miRNA在前列腺癌的惡性進(jìn)展中扮演著至關(guān)重要的作用。本課題組前期研究通過臨床相關(guān)性研究分析在激素依賴性前列腺癌患者標(biāo)本與去勢抵抗性前列腺癌患者標(biāo)本中表達(dá)顯著差異的miRNA,其中miR-744在去勢抵抗性前列腺癌中的顯著高表達(dá),miR-744是一個(gè)最近被確定的腫瘤相關(guān)基因,在頭頸部相關(guān)腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤、胃癌、肝癌、鼻咽癌、卵巢癌、乳腺癌以及胰腺癌的患者組織中均發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平的異常。然而,目前還未見關(guān)于miR-744在人前列腺癌中研究報(bào)道�；谶@樣的研究現(xiàn)狀,本研究首先通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在前列腺癌的組織和細(xì)胞中驗(yàn)證miR-744的表達(dá)水平,并且通過miR-744表達(dá)失調(diào)的體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn),探討miR-744在前列腺癌中的生物學(xué)功能。最后運(yùn)用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的手段以及結(jié)合熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),進(jìn)一步探究miR-744在前列腺癌中發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機(jī)制。為篩選前列腺癌的生物標(biāo)志物以及今后尋找新的前列腺癌治療靶點(diǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。第一部分miR-744在前列腺癌組織中的差異表達(dá)研究目的:隨著我國人口老齡化的加劇以及臨床診斷技術(shù)的進(jìn)步,前列腺癌的發(fā)病率及檢出率呈逐年上升趨勢。前列腺癌早期大多為激素依賴性前列腺癌(ADPC),雄激素剝奪治療對大多數(shù)患者均有明顯效果,但一般在經(jīng)過14-30個(gè)月的中位時(shí)間后,幾乎所有患者最終均轉(zhuǎn)變?yōu)槿莸挚剐郧傲邢侔?CRPC),這一階段的患者對內(nèi)分泌治療以及放化療均不敏感,進(jìn)入了難以治愈的階段,并且疾病的進(jìn)展十分迅速。目前,分子生物學(xué)方面的研究在臨床上已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)、診斷、治療前列腺癌惡性進(jìn)展的熱點(diǎn)。miRNA在轉(zhuǎn)錄后翻譯水平調(diào)控編碼基因的表達(dá),影響細(xì)胞的增殖、凋亡、分化以及惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究方法:在前期研究中,課題組通過臨床收集16例ADPC組織與12例CRPC組織在液氮中保存,取3例ADPC組織與3例CRPC組織進(jìn)行miRNAs表達(dá)譜芯片檢測分析。篩選差異表達(dá)的microRNA后,本部分研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)和原位雜交(ISH)分別在組織標(biāo)本中予以驗(yàn)證。同時(shí),下載美國紀(jì)念斯隆凱瑟琳癌癥研究中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center, MSKCC)數(shù)據(jù)庫中前列腺癌患者的miRNA表達(dá)基因芯片數(shù)據(jù)后,利用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法分析差異表達(dá)的miRNA在前列腺癌中的診斷作用以及與預(yù)后生化復(fù)發(fā)的關(guān)系。研究結(jié)果:前期miRNA表達(dá)譜芯片檢測分析發(fā)現(xiàn)在ADPC與CRPC組織中存在顯著差異表達(dá)的miRNA,其中miR-744在惡性程度較高的CRPC組織中較ADPC顯著高表達(dá)。本部分研究并且通過qRT-PCR和ISH驗(yàn)證了 miR-744在不同前列腺癌組織標(biāo)本中的差異表達(dá)(P0.001)。同時(shí),對MSKCC數(shù)據(jù)庫中下載的前列腺癌患者資料進(jìn)行二次分析,Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示在98例前列腺癌患者中,以中位數(shù)為截點(diǎn)將前列腺癌組分為miR-744高表達(dá)組和miR-744低表達(dá)組,miR-744高表達(dá)組的患者生化復(fù)發(fā)時(shí)間短(P0.0001)。并且通過多因素COX回歸分析得出miR-744是前列腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究結(jié)論:通過上述研究結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)miR-744在CRPC中的表達(dá)較ADPC中顯著增高,隨著前列腺癌的惡性進(jìn)展而升高,提示miR-744能夠用于診斷前列腺癌的惡性進(jìn)展。第二部分miR744對前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響研究目的:前列腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素相互作用的復(fù)雜過程,涉及許多基因在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的選擇性表達(dá)。在第一部分中,我們通過前期miRNA芯片表達(dá)譜分析并結(jié)合qRT-PCR以及ISH檢測驗(yàn)證了 miR-744在CRPC組織中表達(dá)與ADPC組織中相比顯著升高,并且通過對國外數(shù)據(jù)庫中結(jié)果分析后得出miR-744前列腺癌的預(yù)后密切相關(guān)。但miR-744在人前列腺癌中的具體作用尚無系統(tǒng)的相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證報(bào)道。因此,miR-744是否參與了前列腺癌的惡性進(jìn)展,在前列腺癌由激素依賴向趨勢抵抗這一轉(zhuǎn)化過程中又扮演了怎樣的角色,在本部分研究中,我們通過體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn),探討miR-744在激素依賴性前列腺癌細(xì)胞系以及去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞系中對細(xì)胞凋亡比例、細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞遷移和侵襲能力以及裸鼠活體皮下成瘤能力的影響。研究方法:在激素依賴性前列腺癌細(xì)胞系(LNCAP)以及去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞系(PC3和DU145)中采用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測miR-744的表達(dá)量。并且通過體外功能實(shí)驗(yàn)在LNCAP、DU145和PC3細(xì)胞中分別過表達(dá)與干擾miR-744表達(dá)后,通過MTT和低密度細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測miR-744對前列腺癌細(xì)胞增殖能力的影響;流式細(xì)胞技術(shù)檢測miR-744對前列腺癌細(xì)胞凋亡能力的影響;Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測miR-744對前列腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-744對不同前列腺癌細(xì)胞系(LNCAP和PC3)體內(nèi)成瘤能力的影響,并通過ISH和免疫組化(IHC)檢測各組移植瘤體標(biāo)本中miR-744以及Ki-67、CD31/34、Caspase-3等增殖凋亡以及血管生成相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)一步佐證miR-744對前列腺癌細(xì)胞增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。研究結(jié)果:qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DU145和PC3細(xì)胞中的miR-744表達(dá)水平與LNCAP細(xì)胞相比顯著升高(P0.01)。MTT實(shí)驗(yàn)和低密度細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明在miR-744表達(dá)量相對較低的LNCAP細(xì)胞中過表達(dá)miR-744后較對照組(NC組)相比能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖能力(P0.05)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-744組與NC組相比能夠顯著降低LNCAP細(xì)胞凋亡的比例(P0.05)。在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中,過表達(dá)miR-744后能夠明顯促進(jìn)LNCAP細(xì)胞的侵襲和遷移能力(P0.05)。裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)表明,過表達(dá)miR-744組的細(xì)胞瘤體大小和體積明顯大于對照組(P0.05),同時(shí)在皮下移植瘤體的病理切片中,免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞增殖相關(guān)基因Ki-67的表達(dá)顯著升高。同時(shí),在miR-744表達(dá)量相對較高的DU145和PC3細(xì)胞中干擾miR-744的表達(dá)后,通過MTT實(shí)驗(yàn)和低密度細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)miR-744低表達(dá)組中的細(xì)胞增殖能力相較NC組顯著降低。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明干擾miR-744表達(dá)后,DU145和PC3細(xì)胞凋亡的比例與NC組相比明顯升高。Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測后發(fā)現(xiàn),低表達(dá)miR-744后,DU145和PC3細(xì)胞的侵襲和遷移能力與NC組相比受到明顯的抑制。裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)表明,干擾miR-744表達(dá)組的細(xì)胞瘤體大小和體積明顯小于對照組(P0.05),同時(shí)在皮下移植瘤體的病理切片中,免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞增殖相關(guān)基因Ki-67、血管生成影響因子CD31、CD34的表達(dá)均顯著降低,細(xì)胞凋亡相關(guān)基因caspase-3的表達(dá)明顯升高。研究結(jié)論:以上研究結(jié)果表明miR-744的高表達(dá)能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,并抑制細(xì)胞凋亡。相反的,干擾miR-744表達(dá)后,前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力受到明顯的抑制,細(xì)胞的凋亡比例升高。由此可以得出結(jié)論,miR-744在前列腺癌中發(fā)揮了促癌基因的作用。第三部分miR-744靶向NKD1激活WNT/β-catenin信號通路研究目的:從第二部分的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)miR-744的表達(dá)失調(diào)可以影響前列腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力,發(fā)揮促癌基因的作用。但是miR-744發(fā)揮作用的機(jī)制目前尚未清楚。如上文所述,miRNA通過堿基互補(bǔ)配對的方式與靶基因mRNA的3'UTR區(qū)域結(jié)合,降解mRNA或抑制mRNA的翻譯。因此,在明確了 miR-744的生物學(xué)特性之后,我們將著重探討miR-744發(fā)揮功能作用的分子生物學(xué)機(jī)制。研究方法:通過昂飛(Affymetrix)人類全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)結(jié)合miRNA靶基因預(yù)測分析軟件(miRNADA、TargetScan、RNA22-HSA),我們發(fā)現(xiàn)裸角質(zhì)蛋白同系物1 (NKD1)是miR-744在前列腺癌中的潛在靶基因,并且在細(xì)胞內(nèi)采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)以及Western Blot實(shí)驗(yàn),以及在人前列腺癌和裸鼠皮下瘤體組織的標(biāo)本內(nèi)利用ISH和IHC實(shí)驗(yàn)同時(shí)驗(yàn)證miR-744和NKD1之間的表達(dá)關(guān)系。通過KEGG通路分析芯片結(jié)果后發(fā)現(xiàn)miR-744表達(dá)失調(diào)后,WNT/β-catenin信號通路上的關(guān)鍵負(fù)向調(diào)控因子NKD1、GSK3β、SFRP1和TLE3在miR-744失調(diào)后均發(fā)生顯著差異表達(dá),這表明miR-744在前列腺癌中可能通過調(diào)控WNT/β-catenin信號通路發(fā)揮其促進(jìn)基因的作用,并且通過TOP/FOP實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。最后,我們通過功能學(xué)回復(fù)實(shí)驗(yàn),在細(xì)胞中進(jìn)一步驗(yàn)證miR-744對前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的生物學(xué)功能是通過調(diào)控NKD1來實(shí)現(xiàn)的。研究結(jié)果:熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)以及Western Blotting實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果均表明miR-744可直接與NKD1的3'UTR區(qū)域結(jié)合,抑制了 NKD1蛋白的表達(dá)(P0.05)。ISH以及IHC實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在人體前列腺癌組織切片中以及裸鼠原位皮下移植瘤體組織切片中,miR-744與NKD1的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。TOP/FOP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-744的表達(dá)失調(diào)能夠通過調(diào)控NKD1從而影響WNT/β-catenin信號通路的激活(P0.05)。通過功能學(xué)回復(fù)實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染miR-744干擾片段和NKD1干擾質(zhì)粒后,細(xì)胞的增殖和侵襲能力相比較只干擾了 miR-744表達(dá)的實(shí)驗(yàn)組而言顯著升高。上述實(shí)驗(yàn)更進(jìn)一步驗(yàn)證了 miR-744與NKD1之間的靶向調(diào)控關(guān)系。研究結(jié)論:NKD1是miR-744的直接靶基因,miR-744靶向NKD1激活了 WNT/β-catenin信號通路,并且miR-744對前列腺癌生物學(xué)功能的影響是通過調(diào)控NKD1實(shí)現(xiàn)的。第四部分NKD1在前列腺癌中的功能學(xué)研究研究目的:在第三部分中,我們已經(jīng)證實(shí)了 miR-744在前列腺癌中可以直接靶向抑制NKD1的表達(dá),并且通過抑制NKD1激活了 WNT/β-catenin信號通路,同時(shí)也進(jìn)一步驗(yàn)證了 miR-744對前列腺癌生物學(xué)功能的影響是通過調(diào)控NKD1實(shí)現(xiàn)的。并且通過IHC實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢發(fā)現(xiàn)NKD1在CRPC組織標(biāo)本中的表達(dá)相對于ADPC顯著降低。目前關(guān)于NKD1在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況以及其發(fā)揮的生物學(xué)功能還尚未見報(bào)道。因此,我們有必要檢測NKD1在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況,并且進(jìn)一步探究在前列腺癌中NKD1發(fā)揮的生物學(xué)功能。研究方法:在前列腺癌細(xì)胞系LNCAP、DU145和PC3中采用Western Blotting實(shí)驗(yàn)檢測NKD1的差異表達(dá)。并且構(gòu)建NKD1的過表達(dá)以及干擾質(zhì)粒,通過MTT和低密度細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測NKD1對前列腺癌細(xì)胞增殖能力的影響;Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測NKD1對前列腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。研究結(jié)果:qRT-PCR和Western Blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DU145和PC3細(xì)胞中的NKD1表達(dá)水平與LNCAP細(xì)胞相比顯著降低(P0.01)。MTT實(shí)驗(yàn)和低密度細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明在NKD1表達(dá)量相對較高的LNCAP細(xì)胞中干擾NKD1表達(dá)后較對照組(NC組)相比能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖能力(P0.05)。在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中,干擾NKD1表達(dá)后能夠明顯促進(jìn)LNCAP細(xì)胞的侵襲和遷移能力(P0.05)。同時(shí),在NKD1表達(dá)量相對較低的DU145和PC3細(xì)胞中過表達(dá)NKD1后,通過MTT實(shí)驗(yàn)和低密度細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)NKD1過表達(dá)組中的細(xì)胞增殖能力相較NC組顯著降低(P0.05)。Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測后發(fā)現(xiàn),過表達(dá)NKD1后,DU145和PC3細(xì)胞的侵襲能力與NC組相比受到明顯的抑制(P0.05)。研究結(jié)論:以上研究結(jié)果表明NKD1在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)呈顯著差異,并且NKD1的表達(dá)失調(diào)對前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生了顯著的影響,由此得出,NKD1在前列腺癌中發(fā)揮了抑癌基因的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.25

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 宋豎旗;張亞強(qiáng);盧建新;;“骨頭不痛” 前列腺癌 悄悄在轉(zhuǎn)移[J];家庭中醫(yī)藥;2014年05期

2 林志弟;莫林鍵;張成東;宣強(qiáng);張悅寧;莫曾南;滕若冰;楊小麗;;高表達(dá)重組人組織激肽釋放酶7基因的前列腺癌單克隆細(xì)胞株的構(gòu)建[J];山東醫(yī)藥;2014年10期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 關(guān)翰;miR-744在前列腺癌惡性進(jìn)展中的作用及機(jī)制研究[D];東南大學(xué);2017年

2 黃燁清;miR-146a對前列腺癌糖代謝功能影響的研究及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制[D];東南大學(xué);2017年

3 阿卜杜（ABDULALAM ABDULRAB M.F）;神經(jīng)降壓素在去勢抵抗性前列腺癌神經(jīng)內(nèi)分泌分型中的應(yīng)用[D];天津醫(yī)科大學(xué);2017年

4 張慧明;ALKBH與前列腺癌關(guān)系的初步研究[D];鄭州大學(xué);2017年

5 王亮;HSPC111基因表達(dá)與前列腺癌放射敏感性關(guān)系的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2017年

6 王磊;Davinci機(jī)器人系統(tǒng)在前列腺癌手術(shù)中的臨床應(yīng)用研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2017年

7 付曉亮;MicroRNA-103靶向PDCD10抑制前列腺癌的作用及機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2017年

8 呂麗媛;丹參提取物對人前列腺癌干細(xì)胞生物學(xué)行為的干預(yù)作用及機(jī)制研究[D];中國中醫(yī)科學(xué)院;2017年

9 姜行康;microRNA-503通過ZNF217抑制前列腺癌進(jìn)展的機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2017年

10 田煥書;miR-218調(diào)控前列腺癌腫瘤干細(xì)胞干性及其分子機(jī)制研究[D];暨南大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 黃振;Hsa-miR-19b-1-5p在前列腺癌中的作用及其機(jī)制的研究[D];青島大學(xué);2017年

2 岳園園;靶向前列腺癌的兩種探針的研究[D];鄭州大學(xué);2017年

3 江芮;DCE流出型曲線及PI-RADS V2應(yīng)用于前列腺診斷的價(jià)值[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2017年

4 馬宇坤;PCA3檢測在PSA灰區(qū)對前列腺癌診斷及病理分級的價(jià)值[D];山西醫(yī)科大學(xué);2017年

5 馬志明;SIRT1在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究[D];蘭州大學(xué);2017年

6 鄭義;動(dòng)態(tài)增強(qiáng)磁共振對前列腺癌的診斷價(jià)值的系統(tǒng)評價(jià)和meta分析[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2017年

7 林志偉;磁共振參數(shù)ADC值結(jié)合MRS參數(shù)CC/C值對前列腺癌早期診斷的探討[D];鄭州大學(xué);2017年

8 方程;GnRH拮抗劑地加瑞克治療前列腺癌的安全性及有效性的Meta分析[D];蘭州大學(xué);2017年

9 花晨朝;經(jīng)腹與經(jīng)腹膜外途徑機(jī)器人輔助腹腔鏡根治性前列腺切除術(shù)治療前列腺癌的Meta分析[D];蘭州大學(xué);2017年

10 孫恒;P504S、P63、CK34βE12在前列腺癌中的表達(dá)及其相關(guān)研究[D];濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院;2017年

，

本文編號：1663899