發(fā)布時(shí)間：2018-03-24 16:54

  本文選題：HP1γ　切入點(diǎn)：結(jié)直腸癌　出處：《南京大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：結(jié)直腸癌(CRC)是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率及死亡率均居惡性腫瘤的第3位。在我國(guó),結(jié)直腸癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第3位,死亡率居惡性腫瘤的第5位。隨著人民生活水平的提高和生活方式的轉(zhuǎn)變,其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì),極大的威脅著人類健康,其主要原因在于人們對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)病分子機(jī)制方面的研究一直沒(méi)有取得重大的突破。因此,深入研究結(jié)直腸癌發(fā)病的分子機(jī)制,對(duì)結(jié)直腸癌早期診斷、臨床治療及預(yù)后都有著重要的意義。異染色質(zhì)蛋白1-g(Heterochromatin protein 1-g,HP1γ)屬于異染色質(zhì)蛋白家族成員,由CBX3(Chromobox homolog 3)基因編碼。作為染色質(zhì)的特殊形式,HP1γ在很多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用,例如異染色質(zhì)的形成與基因沉默、DNA損傷修復(fù)、RNA剪接、轉(zhuǎn)錄激活、干細(xì)胞分化以及體細(xì)胞的重編程過(guò)程等。鑒于其分布廣泛性,以及在基因調(diào)節(jié)中的不同作用,HP1γ很可能密切地參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。然而,HP1γ在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制尚不明確,有待深入研究闡明。為了解HP1γ在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況,我們首先在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)HP1γ表達(dá)情況進(jìn)行了初步分析,分析結(jié)果表明HP1γ在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)。為了驗(yàn)證這一結(jié)果,我們制備了包含180例結(jié)直腸癌標(biāo)本及配對(duì)的癌旁正常對(duì)照的組織芯片,隨后利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)了HP1γ蛋白在180例結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況,并詳細(xì)分析了HP1γ的表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤尺寸、位置、分化程度、轉(zhuǎn)移和TNM分期等臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示在結(jié)直腸癌組織中HP1γ蛋白表達(dá)水平顯著高于正常組織(n=178,P0.001),并且發(fā)現(xiàn)HP1γ的表達(dá)與腫瘤分化程度呈顯著負(fù)相關(guān)(P0.05)。隨后,我們運(yùn)用Kaplan-Meier法分析了180例結(jié)直腸癌患者的生存數(shù)據(jù),并用Log-Rank檢驗(yàn)分析比較了HP1γ高表達(dá)和低表達(dá)二者之間生存曲線的差異。結(jié)果顯示,HP1γ的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的生存率之間呈負(fù)相關(guān),在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有非常顯著的差異(P=0.001)。另外,在38例新鮮結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中,我們通過(guò)Western blot和Real-time PCR實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)HP1γ蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著高于其配對(duì)的癌旁正常組織(P0.01)。鑒于HP1γ在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況,我們推測(cè)HP1γ在結(jié)直腸癌中可能扮演促癌基因的角色。為了驗(yàn)證這一推測(cè),我們對(duì)HP1γ在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能進(jìn)行了深入詳細(xì)的研究。我們通過(guò)CCK-8、EdU、平板克隆形成、Transwell、劃痕愈合、流式細(xì)胞周期與凋亡、裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)分析檢測(cè)了HP1γ表達(dá)沉默后對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、克隆形成、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期與凋亡、體內(nèi)成瘤能力的影響。結(jié)果表明,HP1γ表達(dá)沉默后結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、克隆形成及體內(nèi)成瘤能力被抑制,但對(duì)轉(zhuǎn)移能力沒(méi)有顯著影響。而且,流式細(xì)胞周期分析結(jié)果也顯示HP1γ表達(dá)沉默后會(huì)導(dǎo)致結(jié)直腸癌細(xì)胞被阻滯在G1期,這暗示著HP1γ可能通過(guò)細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖,也進(jìn)一步表明HP1γ在結(jié)直腸癌中扮演促癌基因的角色,暗示著HP1γ有可能成為將來(lái)治療結(jié)直腸癌的一個(gè)新的靶點(diǎn)。隨后,通過(guò)Real-time PCR實(shí)驗(yàn)我們對(duì)HP1γ表達(dá)沉默后細(xì)胞增殖和周期調(diào)控相關(guān)的一些關(guān)鍵基因進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)HP1γ表達(dá)沉默后會(huì)導(dǎo)致p21~(Waf1/Cip1) mRNA(P0.01)和蛋白水平顯著上調(diào)。p21~(Waf1/Cip1)是一個(gè)抑癌基因,是細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換的負(fù)調(diào)控因子。為了弄清HP1γ是否結(jié)合在p21~(Waf1/Cip1)基因啟動(dòng)子上來(lái)調(diào)節(jié)其表達(dá),我們利用染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)技術(shù)分析了HP1γ在p21~(Waf1/Cip1)基因啟動(dòng)子上的結(jié)合情況。我們?cè)趐21~(Waf1/Cip1)基因啟動(dòng)子上不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行Real-time PCR分析,結(jié)果表明,HP1γ在p21~(Waf1/Cip1)基因啟動(dòng)子-297~-191處結(jié)合最強(qiáng),但在更遠(yuǎn)的啟動(dòng)子區(qū)域如-2596~-2414和-2069~-1906處則沒(méi)有結(jié)合。此外,當(dāng)HP1γ表達(dá)沉默以后HP1γ在p21~(Waf1/Cip1)基因啟動(dòng)子上的結(jié)合顯著減弱(P0.01)。因此,HP1γ可以結(jié)合在p21~(Waf1/Cip1)基因啟動(dòng)子上來(lái)調(diào)節(jié)其表達(dá),為典型的負(fù)調(diào)控方式。由于H3K9me2/3(組蛋白H3第9位賴氨酸2/3甲基化)是HP1家族在染色質(zhì)上最主要的結(jié)合位點(diǎn),我們想確定HP1γ是否會(huì)影響p21~(Waf1/Cip1)基因啟動(dòng)子上組蛋白標(biāo)記H3K9me2/3水平。我們利用ChIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了p21~(Waf1/Cip1)基因啟動(dòng)子上H3K9me2/3修飾情況。結(jié)果表明,p21~(Waf1/Cip1)基因啟動(dòng)子上存在H3K9me2/3修飾;并且當(dāng)HP1γ表達(dá)沉默以后,p21~(Waf1/Cip1)基因啟動(dòng)子處的H3K9me2/3水平均會(huì)顯著降低(P0.01),其中H3K9me3水平降低更為顯著。這個(gè)結(jié)果表明HP1γ調(diào)控p21~(Waf1/Cip1)基因表達(dá)涉及到組蛋白甲基化修飾。微小RNA(miRNA)在細(xì)胞生命活動(dòng)中具有廣泛的調(diào)節(jié)功能,自從被發(fā)現(xiàn)以來(lái)已經(jīng)成為生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)。我們通過(guò)TargetScan,PicTar和mi Randa在線miRNA-靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站篩選出miR-30a(Hsa-miR-30a-5p)可能會(huì)靶向結(jié)合HP1γ基因。利用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)我們證明了miR-30a可直接結(jié)合在HP1γmRNA的3’-UTR上并抑制熒光素酶的表達(dá)。在結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和SW620中miR-30a過(guò)表達(dá)顯著抑制了HP1γ蛋白水平的表達(dá),但對(duì)HP1γmRNA水平無(wú)顯著影響。并且在38例新鮮結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中mi R-30a和HP1γ蛋白表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.5981,P0.01),提示著miR-30a在結(jié)直腸癌中可以抑制HP1γ蛋白表達(dá)。隨后我們?cè)隗w外、體內(nèi)對(duì)miR-30a在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)功能展開(kāi)了研究,結(jié)果表明miR-30a可以通過(guò)下調(diào)HP1γ的表達(dá)來(lái)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。除此之外,miR-30a還可以抑制HCT116細(xì)胞克隆形成、阻滯細(xì)胞周期過(guò)程及促進(jìn)細(xì)胞凋亡,在結(jié)直腸癌細(xì)胞中扮演著抑癌基因的角色。本研究將結(jié)直腸癌組織中HP1γ蛋白水平的上調(diào)與miR-30a下調(diào)聯(lián)系起來(lái),通過(guò)調(diào)控p21~(Waf1/Cip1)基因轉(zhuǎn)錄來(lái)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。miR-30a/HP1γ/p21~(Waf1/Cip1)級(jí)聯(lián)機(jī)制為結(jié)直腸癌發(fā)病分子機(jī)制提供了新的解釋,豐富了結(jié)直腸癌發(fā)病的分子機(jī)制,對(duì)揭示其發(fā)病的精細(xì)分子機(jī)制、開(kāi)發(fā)有效的治療措施及判斷預(yù)后,進(jìn)一步提高我國(guó)結(jié)直腸癌的治療水平具有重要的臨床價(jià)值和社會(huì)效益。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.3

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本文編號(hào)：1659186