本文選題：藥物代謝酶　切入點(diǎn)：穩(wěn)定同位素稀釋平行反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜法　出處：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景I相藥物代謝酶細(xì)胞色素P450氧化酶(cytochrome P450 oxidase,CYP450)和II相藥物代謝酶尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronide transferases,UGTs)主要存在于肝臟中,參與多種內(nèi)外源性化合物(包括藥物)的代謝,Cytochrome P450 oxidoreductase(POR)和cytochrome b5(b5)作為藥物代謝酶的供電子物質(zhì)在藥物代謝中也具有重要的作用。CYP450和UGTs的多態(tài)性和含量差異是引起藥物藥效個體差異的重要因素,肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我國常見的腫瘤之一,臨床上,肝癌及其并發(fā)癥治療時藥物的劑量需要及時調(diào)整,然而,作為劑量調(diào)整的基礎(chǔ),CYP及UGT的含量在HCC病人中是如何改變的,至今尚不完全清楚,因此,CYP450和UGTs含量的研究對肝癌病人臨床個體化治療方案的制定有重要意義。目前測定肝藥酶含量的常用方法有免疫印跡法(Western blot)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)。其中,基于抗原抗體結(jié)合原理的Western blot法和ELISA法雖具有高靈敏度的特點(diǎn),但特異性抗體制備困難,并且無法同時對同一樣本中的多種蛋白定量。而LC-MS/MS不需要制備特異性抗體,并具有高通量、高特異性以及線性范圍寬等特點(diǎn)。本文建立了液相色譜-平行反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜方法(liquid chromatography parallel reaction monitoring mass spectrometry,LC-PRM/MS),與選擇反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜方法相比,LC-PRM/MS能夠獲得二級的所有碎片信息,并且結(jié)果能夠搜庫,保證定量的特異性。我們將建立的方法應(yīng)用于肝癌病人肝硬化組織中的藥物代謝酶含量的測定,期望為肝癌病人的臨床用藥提供參考。本論文共分為兩個部分。第一部分使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)制備了定量肽段串聯(lián)體蛋白(Quantification concatemer,Qcon CAT);第二部分建立了平行反應(yīng)監(jiān)測方法,并將該方法應(yīng)用于藥物代謝酶的定量中。研究方法1.內(nèi)標(biāo)肽段的制備20種藥物代謝酶和POR以及b5各挑選2-3條特異性肽段,將選出的特異性肽段串聯(lián)成為了Qcon CAT蛋白,構(gòu)建可以表達(dá)該蛋白的基因序列,將其導(dǎo)入大腸桿菌后使用含重標(biāo)精氨酸和賴氨酸的SILAC培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)成功的重組蛋白使用GST填料進(jìn)行純化,SDS-PAGE鑒定純度,并使用Trypsin進(jìn)行酶解。2.內(nèi)標(biāo)肽段酶切效率和標(biāo)記效率的考察酶切后的肽段使用數(shù)據(jù)依賴采集模式考察酶切效率和標(biāo)記效率,使用Proteome Discoverer 2.1搜庫檢索,對酶切肽段定性。3.內(nèi)標(biāo)肽段的定量化學(xué)合成一條CYP1A2的標(biāo)準(zhǔn)肽段ASGNLIPQEK,使用氨基酸水解法進(jìn)行定量,將含量已知的標(biāo)準(zhǔn)肽段梯度稀釋,加入等量的內(nèi)標(biāo)肽段,使用液相質(zhì)譜進(jìn)行檢測,計算內(nèi)標(biāo)肽段的含量。4.人肝微粒體的定量及酶切使用差速離心法制備人肝微粒體(Human liver microsomes,HLMs),用Bradford法對人肝微粒體進(jìn)行定量,定量后取出10μg蛋白使用Trypsin酶切26小時。5.液相-質(zhì)譜平行反應(yīng)監(jiān)測方法的建立將定量后的內(nèi)標(biāo)肽段與酶切后的人肝微粒體混合,使用數(shù)據(jù)依賴掃描模式,更換三根預(yù)柱,平行測定兩次,結(jié)果使用Proteome Discoverer 2.1搜庫鑒定,確定目標(biāo)肽段的保留時間和定量限,并篩選用于定量的子離子。6.標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將Qcon CAT蛋白梯度稀釋,加入等量酶切后的人肝微粒體,使用液相色譜-平行反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜方法進(jìn)行掃描,建立定量肽段的標(biāo)準(zhǔn)曲線。7.液相-質(zhì)譜平行反應(yīng)監(jiān)測方法的應(yīng)用將建立的平行反應(yīng)監(jiān)測方法應(yīng)用于肝癌病人肝硬化組織中藥物代謝酶含量的測定。研究結(jié)果1.重組蛋白純度鑒定及定量SDS-PAGE分析結(jié)果表示,表達(dá)的重組蛋白純度較高。使用Bradford法對重組蛋白進(jìn)行定量,標(biāo)準(zhǔn)品的方程為y=9.8617x+0.1537,R2=0.9876,蛋白濃度為0.56 mg/m L。2.重組蛋白的定性使用Proteome Discoverer 2.1搜庫匹配目標(biāo)蛋白質(zhì)信息,所有內(nèi)標(biāo)肽段均為目標(biāo)蛋白的特異性肽段,匹配情況良好。3.重組蛋白酶切效率及標(biāo)記效率的考察經(jīng)分析,純化蛋白僅存在一個漏切位點(diǎn),占所有肽段的10%以下,即酶切效率高,各個肽段標(biāo)記的均一性良好,標(biāo)記效率均達(dá)到90%。4.重組蛋白的絕對定量使用子離子y5和y4的平均值作為Qcon CAT的定量結(jié)果,即134.75fmol;與兩組定量曲線使用母離子的定量結(jié)果相差不到1.1倍。5.定量肽段保留時間和子離子的設(shè)置相同肽段使用不同色譜柱進(jìn)行色譜分離時,肽段的保留時間存在的偏差,而在同一色譜柱上對相同肽段的保留時間偏差小于1分鐘。使用搜庫結(jié)果中信號強(qiáng)度最高的三個子離子用于肽段的定量。6.標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立使用PRM方法建立藥物代謝酶定量肽段的標(biāo)準(zhǔn)曲線,R2值均在0.98以上,動態(tài)范圍為5-200fmol。7.肝癌病人肝硬化組織中藥物代謝酶的定量共測定12例樣本中6種藥物代謝酶的含量。CYP1A2、UGT1A1、UGT2B4、UGT2B15、POR以及b5在樣本中的含量均值分別為67.36 fmol/μg、87.25 fmol/μg、92.97 fmol/μg、53.01 fmol/μg、140.65 fmol/μg以及84.91 fmol/μg。個體差異倍數(shù)分別為6.5、5.02、5.24、4.33、6.17和4.02倍;與正常組織相比,POR在肝癌病人的肝硬化組織呈高表達(dá),UGT1A1與UGT2B15的含量與正常組織比有所降低,且差異顯著(p0.05)。結(jié)論1.本研究構(gòu)建了串聯(lián)體蛋白,實現(xiàn)了規(guī)�；瘍�(nèi)標(biāo)肽段的制備,并保證了內(nèi)標(biāo)的純度與標(biāo)記效率;2.建立了藥物代謝酶的PRM分析方法,在此基礎(chǔ)上建立了絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性關(guān)系為0.99,動態(tài)范圍為5-200fmol;3.使用建立的方法測定了12例樣本中6種藥物代謝酶的含量,CYP1A2、UGT1A1、UGT2B4、UGT2B15、POR以及b5在樣本中的含量均值分別為67.36 fmol/μg、87.25 fmol/μg、92.97 fmol/μg、53.01 fmol/μg、140.65 fmol/μg以及84.91fmol/μg。將結(jié)果與正常組織的結(jié)果進(jìn)行比較,POR在肝癌病人的肝硬化組織呈高表達(dá),UGT1A1與UGT2B15的含量與正常組織比有所降低,且差異顯著(P0.05)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 姚欣;肝外藥物代謝酶的研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).藥學(xué)分冊;2003年02期

2 單毓娟,吳坤,于建武;藥物代謝酶維生素E琥珀酸酯抑制苯并(a)芘[J];中國公共衛(wèi)生;2004年07期

3 胡宜;;現(xiàn)代醫(yī)學(xué)200詞 191.藥物代謝酶[J];日本醫(yī)學(xué)介紹;2007年09期

4 康春蓉;;藥物代謝酶對藥物在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化的影響及臨床意義[J];中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用;2011年18期

5 周鼎;;甲基丙烯酸甲酯對大鼠肝腎非蛋白巰基和藥物代謝酶的作用[J];鐵道勞動衛(wèi)生通訊;1986年01期

6 薛秉文;;藥物代謝酶的臨床意義[J];中原醫(yī)刊;1989年03期

7 陸宏，劉耕陶;藥物代謝酶與免疫系統(tǒng)──機(jī)體的“清潔”系統(tǒng)[J];中國藥理學(xué)通報;1995年03期

8 陳育民;;藥酶的神奇作用[J];藥物與人;1997年03期

9 楊子釗;于琴琴;余露山;孫紅穎;曾蘇;;藥物代謝酶的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展[J];中國藥學(xué)雜志;2013年17期

10 陳水錦;;絡(luò)合劑對大鼠藥物代謝酶的作用[J];國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊);1981年03期

相關(guān)會議論文 前10條

1 俞春娜;尤琳雅;曾蘇;;重組藥物代謝酶的研究與應(yīng)用[A];第八次全國藥物與化學(xué)異物代謝學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2006年

2 劉亮;楊琳;艾小非;王建祥;肖志堅;;漢族人群藥物代謝酶相關(guān)基因常見多態(tài)性位點(diǎn)基因型的分布頻率[A];第12屆全國實驗血液學(xué)會議論文摘要[C];2009年

3 王黎青;王勇;鄧勛;徐峰;;藥物代謝酶細(xì)胞色素P4501A2的研究[A];2010年廣東省藥師周大會論文集[C];2011年

4 丁虹;彭仁t;;枯否細(xì)胞對肝佭藥物代謝酶的調(diào)節(jié)作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[A];海峽兩岸三地藥理學(xué)學(xué)術(shù)報告會論文匯編[C];2001年

5 郭喻;王婷;肖鳳琴;汪暉;;妊娠狀態(tài)和孕期煙霧暴露對大鼠肝臟藥物代謝酶活性的影響及其意義[A];第八次全國藥物與化學(xué)異物代謝學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2006年

6 陳樞青;;藥物代謝酶類與藥物作用個體差異[A];第四屆全國中西醫(yī)結(jié)合戒毒學(xué)術(shù)研討會教材、論文摘要集[C];2000年

7 曾蘇;;應(yīng)用重組藥物代謝酶評價藥物候選物的ADME性質(zhì)[A];第九屆全國藥物和化學(xué)異物代謝學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

8 史美甫;;藥物代謝酶與藥品不良反應(yīng)[A];浙江省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會臨床藥學(xué)專業(yè)委員會第六次學(xué)術(shù)年會暨省級繼續(xù)教育學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2006年

9 郝大程;李明霞;肖培根;彭勇;董學(xué)偉;;藥物代謝酶UDP-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶的分子進(jìn)化——物種間序列比較(英文)[A];2011年中國藥學(xué)大會暨第11屆中國藥師周論文集[C];2011年

10 王靖方;魏冬青;;藥物代謝酶P450的計算生物學(xué)研究[A];中國數(shù)學(xué)力學(xué)物理學(xué)高新技術(shù)交叉研究學(xué)會第十二屆學(xué)術(shù)年會論文集[C];2008年

相關(guān)重要報紙文章 前2條

1 吳連福;家禽防御機(jī)能的營養(yǎng)調(diào)節(jié)[N];中國畜牧報;2004年

2 毛靜怡;夏季用藥該注意什么[N];健康報;2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前6條

1 王宇光;基于藥物代謝酶的中藥相互作用研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2006年

2 李筱雯;干擾素對豬肝臟關(guān)鍵藥物代謝酶CYP3A29的表達(dá)調(diào)控研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

3 戴立波;藥物過量時激活PXR介導(dǎo)調(diào)控藥物代謝酶與轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)錄促進(jìn)毒物消除的解毒機(jī)制研究[D];中南大學(xué);2014年

4 閆良;孕烷X受體介導(dǎo)的藥物代謝酶CYP3A4誘導(dǎo)表達(dá)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制[D];鄭州大學(xué);2017年

5 高利臣;阿魏酸對藥物代謝酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的影響及其與CYP2B6，POR和PXR基因多態(tài)性關(guān)系[D];中南大學(xué);2012年

6 王會娟;抗腫瘤藥物在人肝微粒體中的代謝表型與相關(guān)藥物代謝酶基因型的關(guān)聯(lián)性研究[D];西北大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 賈英;PiggyBac介導(dǎo)多藥物代謝酶穩(wěn)定表達(dá)肝細(xì)胞系的建立[D];華南理工大學(xué);2015年

2 王建海;肝移植患者外周血中藥物代謝酶基因表達(dá)的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2016年

3 王勤輝;燈心草菲類成分代謝特征及其對藥物代謝酶活性影響研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2017年

4 劉喜東;藥物代謝酶的生物質(zhì)譜絕對定量方法發(fā)展及其應(yīng)用研究[D];吉林大學(xué);2014年

5 李健;藥物代謝酶基因熱點(diǎn)突變檢測芯片的研制與應(yīng)用[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

6 陳融;藥物代謝酶CYP2S1,CYP2R1和CYP2J2在中國不同民族群體遺傳學(xué)研究[D];西北大學(xué);2016年

7 楊秀偉;建立具有藥物代謝酶CYP2C9活性的微生物模型[D];吉林大學(xué);2005年

8 逄麗艷;初步建立具有藥物代謝酶CYP3A4活性的微生物模型[D];沈陽藥科大學(xué);2007年

9 王月雯;中國藏、漢人群CYP2C9多態(tài)性比較分析及藏族人群UGT1A9，，1A7，1A1多態(tài)性分析[D];西北大學(xué);2012年

10 許力;藥物代謝酶CYP450熱點(diǎn)突變檢測芯片的研制與應(yīng)用[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2006年

本文編號：1644057