本文選題：JunD　切入點：官頸癌　出處：《浙江大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：宮頸癌是全球女性第四大常見惡性腫瘤,也是全球女性排名第四的死亡原因。雖然隨著篩查的大規(guī)模開展,手術及放化療的長足進展,宮頸癌的發(fā)生率和死亡率有一定下降,但中晚期宮頸癌患者的預后仍然不盡如人意,尋找中晚期宮頸癌有效的治療方法對改善該類患者的預后意義重大。高危人乳頭瘤病毒(High Risk Human papillomavirus, HR-HPV)持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生與進展的必要因素。病毒癌基因通過影響宿主細胞的相關分子來擴大自身癌基因的惡性效應,探索宿主細胞中受病毒影響的相關分子,是臨床研究中尋找潛在治療靶標的重點。JunD蛋白是由JUND基因編碼,最晚加入Jun家族的成員,其表達方式及生物學功能與家族其它成員并不相同。JunD激活或抑制各種不同的靶基因介導細胞增殖、凋亡和分化等功能。在腫瘤細胞中,JunD蛋白的表達紊亂、對JunD的調控異常及與其它因子如MEN1、cyclinD、p21、MMP-7等的相互作用,參與腫瘤的形成、轉移、血管生成等過程。為了明確JunD在宮頸癌進展中的功能及分子機制,本研究首先利用細胞功能實驗探索JunD在宮頸癌中對細胞生物學行為的影響,再通過生物信息學方法尋找靶基因,通過基因功能實驗驗證及確定其發(fā)揮作用的靶基因,明確靶基因在宮頸癌中的功能,最后利用宮頸相關組織樣本驗證JunD及靶基因的組織相關性,并比較分析JunD與靶基因的表達水平與宮頸不良預后病理參數的相關性。旨在尋找官頸癌潛在的治療靶點,為探索中晚期宮頸癌的治療新策略提供證據。第一部分JunD對宮頸癌細胞生物學行為的影響目的：明確JunD對宮頸癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學行為的調控作用。方法：采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time RT-PCR,qRT-PCR)法和vestern blot檢測JunD在HPV陽性的宮頸癌細胞系和HPV陰性的細胞系的mRNA和蛋白水平。利用細胞轉染技術分別在宮頸癌細胞株SiHa和CaSki中轉染JunD小干擾序列或陰性對照下調JunD的表達,在HPV陰性細胞株U20S中轉染JunD表達質�；蚩蛰d質粒上調JunD的表達,分別通過CCK-8法檢測腫瘤細胞的增殖能力、流式細胞技術檢測細胞凋亡、Transwell聯合或不聯合matrigel實驗檢測細胞的侵襲和遷移能力。結果：1. JunD在HPV陽性宮頸癌細胞株中的表達水平高于在HPV陰性細胞株的表達。2.宮頸癌細胞株SiHa和CaSki中干擾JunD的表達能抑制腫瘤細胞的增殖能力,促進細胞早期凋亡,同時細胞的遷移和侵襲能力均受到明顯抑制。3.HPV陰性細胞株U20S中上調JunD的表達促進細胞增殖,抑制細胞早期凋亡,促進細胞侵襲和遷移。結論：1.在宮頸癌細胞中,JunD的表達促進細胞增殖、抑制凋亡、促進細胞的侵襲和遷移,提示JunD在宮頸癌進展過程中發(fā)揮促癌作用。第二部分JunD基因的生物信息學分析及靶基因的驗證目的：尋找JunD發(fā)揮功能的靶基因,以揭示JunD參與宮頸癌進展的作用和分子機制。方法：對Oncomine數據庫內臨床樣本數據集和細胞系數據集,進行共表達分析篩選可能存在的與JunD共表達的基因。結合BioGRID數據庫篩選可能存在的與JunD有蛋白相互作用關系的共表達分子。利用實時熒光定量PCR(quantitative real-time RT-PCR, qRT-PCR)法對篩選得到的靶分子在HPV陽性的宮頸癌細胞系和HPV陰性的細胞系檢測mRNA水平。利用小干擾技術調控JunD的表達,觀察靶分子的mRNA和蛋白水平的改變,利用免疫共沉淀技術檢測JunD與靶分子的關系。結果：1.通過Oncomine數據庫和BioGRID數據庫預測得到與JunD存在蛋白互作關系并在官頸癌中共表達的分子。2.在HPV陽性的宮頸癌細胞系和HPV陰性的細胞系檢測部分篩選得到的分子,預測得到靶分子SIRT1。3. JunD能與SIRT1結合并同向調控SIRT1的蛋白表達。結論：1. Oncomine數據庫是篩選功能相關目的基因的有效工具。2. SIRT1受JunD轉錄后水平的調控,是JunD的直接靶基因。第三部分SIRT1對宮頸癌細胞生物學行為的影響目的：驗證靶基因SIRT1在宮頸癌中對細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學行為的影響。方法：利用細胞轉染技術在宮頸癌細胞株SiHa中轉染SIRT1小干擾序列或陰性對照序列下調SIRT1的表達,分別通過CCK-8法檢測腫瘤細胞的增殖能力、流式細胞技術檢測細胞凋亡、Transwell聯合或不聯合matrigel實驗檢測細胞的侵襲和遷移能力。實時熒光定量PCR(quantitative real-time RT-PCR,qRT-PCR)法和western blot法檢測SIRT1的mRNA和蛋白水平。結果：1.在宮頸癌細胞株中,干擾SIRT1的表達可抑制SiHa細胞的增殖,促進細胞早期凋亡、并抑制細胞的侵襲和遷移能力。結論：1. SIRT1高表達促進宮頸癌細胞的增殖、侵襲和遷移,并抑制凋亡,提示SIRT1在宮頸癌進展過程中發(fā)揮與JunD類似的促癌作用。第四部分JunD與SIRT1在官頸組織中的表達及意義目的：觀察JunD和SIRT1在宮頸組織中的表達差異及與臨床不良預后因素間的相關性。方法：采用免疫組織化學的方法檢測59例正常官頸上皮組織標本、77例宮頸高級別病變、138例宮頸鱗癌組織中JunD和SIRT1的表達水平,根據收集的病例的臨床相關資料整理其病理信息,分析JunD和SIRT1的表達水平與宮頸癌臨床不良預后病理因素的相關性。結果：1. JunD和SIRT1在宮頸鱗癌中的表達水平高于高級別病變組和正常上皮組織組。2. JunD高表達與FIGO分期、細胞分化程度、脈管浸潤、間質浸潤呈顯著正相關。3. SIRT1高表達與FIGO分期、細胞分化程度、脈管浸潤呈顯著正相關。4. JunD高表達與SIRT1高表達顯著相關。結論：1. JunD翱SIRT1在宮頸癌組織中顯著相關,并且其高表達與官頸癌不良預后因素相關,提示JunD和SIRT1可能具有用于預測宮頸癌預后的潛在價值。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33

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本文編號：1624006