本文選題：肺癌　切入點：C-Raf　出處：《昆明理工大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：癌癥是指起源于上皮組織的惡性腫瘤,而肺癌則是惡性腫瘤中最常見的一類,是全球死亡率和發(fā)病率最高的癌癥,它給人們的生活和身體帶來極大的威脅。因此研究肺癌的發(fā)病機制,尋找治療肺癌的新靶點就顯得更為迫切。Raf激酶(Rapidly Accelerated Fibrosarcoma)逆轉(zhuǎn)錄致癌病毒基因包括A-Raf、B-Raf和C-Raf三種亞型,Raf激酶的突變則是細胞癌變的主要原因之一,A-Raf突變可導致卵巢癌和大腸癌,B-Raf突變和神經(jīng)系統(tǒng)癌變、皮膚癌和胸腺癌相關,C-Raf突變和小細胞肺癌相關,并且在肺癌組織中C-Raf蛋白的表達量明顯增加,因此,調(diào)控C-Raf激酶及其結合蛋白也就成為了治療肺癌的重要手段。然而大多數(shù)癌癥治療方法將注意力集中于單個靶點或單個突變,缺乏從系統(tǒng)的高度對動態(tài)的細胞信號網(wǎng)絡的認識和對其內(nèi)在機制的深入了解。在本研究中,我們以C-Raf的中心蛋白相互作用網(wǎng)絡入手,深入調(diào)查了腫瘤細胞信號網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點在腫瘤發(fā)生中的作用。我們利用蛋白互組,高通量質(zhì)譜分析技術系統(tǒng)性識別了 C-Raf的相互作用蛋白SMC3(Structural maintenance of chromosomes protein 3)染色體結構維持蛋白 3 和 PP2A Aα(protein phyosphatase2A Aα)蛋白磷酸酶 2A Aα。SMC3是黏連蛋白重要組成部分,SMC3和SMC1A亞基通過其鉸鏈結構域二聚化形成'V'形狀,這個'V'與底部的RAD21亞基連接形成一個封閉的三邊環(huán)狀結構,這個環(huán)狀結構能夠包圍姐妹染色體從而介導姐妹染色體粘連蛋白的粘附,并在基因調(diào)控中發(fā)揮關鍵作用,SMC3在S期可以被乙酰化,建立染色質(zhì)加載的粘連蛋白的粘著性,從而影響著細胞的周期。蛋白磷酸酶PP2A Aα是蛋白磷酸酶PP2A(protein phyosphatase2A,PP2A)的重要組成部分之一。PP2A是絲氨酸蘇氨酸型的蛋白磷酸酶,在大多數(shù)的組織和細胞中的含量都非常高,它參與著DNA的復制、基因的轉(zhuǎn)錄、細胞的分化和凋亡、癌基因的轉(zhuǎn)化等一系列的細胞生物學活動,除此之外它還與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有一定的關系,PP2A Aα蛋白的突變與肺癌、子宮癌的發(fā)生有緊密的聯(lián)系。我們分別構建了 SMC3和PP2A Aα蛋白的高表達質(zhì)粒(pcDNA3.1-SMC3/PP2A Aα),敲減質(zhì)粒(pSUPER-SMC3/PP2A Aα)以及敲除質(zhì)粒(px459-SMC3/PP2A Aα),并穩(wěn)轉(zhuǎn)入到非小細胞肺癌A549細胞中,成功的構建了 SMC3/PP2AAα的高表達和敲減穩(wěn)定細胞株。最后,我們通過CCK8法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)pSUPER-SMC3后對A549細胞的增殖情況,發(fā)現(xiàn)穩(wěn)轉(zhuǎn)pSUPER-SMC3的A549細胞的增殖能力與對照組(control)和陰性實驗組(pSUPER)相比明顯下降,差異具有顯著性意義(P0.01),證明PSUPER-SMC3的穩(wěn)轉(zhuǎn)抑制A549細胞的增殖;利用劃痕和Transwell小室實驗檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)pSUPER-SMC3后對A549細胞遷移的情況,實驗組(PSUPER-SMC3)細胞數(shù)明顯少于空白對照組和陰性對照組的細胞數(shù)目,差異具有顯著性意義(P0.05),這就證明下調(diào)SMC3蛋白的表達確實會抑制A549細胞的遷移;用細胞成球?qū)嶒灆z測細胞的成球能力和干性發(fā)現(xiàn)實驗組的細胞成球數(shù)為(19.667±3.055)明顯少于空白對照組(54.333±4.041)和陰性對照組(54.667±3.786),差異具有顯著性意義(P0.05),而空白對照組和陰性對照組細胞成球數(shù)無顯著性意義(P0.05),證明了下調(diào)SMC3蛋白的表達使A549細胞成球數(shù)減少,干性減弱�？偠灾�,我們挑選和確定了 C-Raf的結合蛋白SMC3和PP2AAα,并成功構建了SMC3和PP2A Aα的高表達、敲減和敲除質(zhì)粒,隨后穩(wěn)轉(zhuǎn)入A549細胞中,成功構建了 SMC3和PP2A Aα的高表達細胞株和敲減細胞株。其次證明了 SMC3的沉默會抑制A549細胞的增殖、遷移和成球能力,減弱細胞的干性,這些均是癌細胞生存和腫瘤發(fā)展的重要生物學功能,因此SMC3有望成為肺癌診斷的新的生物標志和治療的藥物靶點。
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【學位授予單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

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本文編號：1610376