本文選題：飛燕草素　切入點：乳腺癌　出處：《成都醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：課題組前期研究表明,源于黑米皮花青素混合物(Black Rice Anthocyanidin,BRACs)對MDA-MB-453乳腺癌細胞(HER-2+)的生長和轉(zhuǎn)移有顯著的抑制作用,對MCF-10A細胞(正常乳腺上皮細胞)幾乎無細胞毒性作用,對MCF-7細胞(HER-2—)毒性作用較小。作為花青素的主要活性單體,飛燕草素(Delphinidin,Dp)對MDA-MB-453細胞是否具有較強的抑制效應(yīng),其機制是什么?目前尚不清楚。自噬和凋亡是調(diào)控腫瘤細胞死亡的兩種主要程序,而自噬是細胞處于惡性微環(huán)境時表現(xiàn)的一種應(yīng)激性反應(yīng),既能保護細胞免于凋亡也可能促進細胞死亡,具有雙刃劍作用。研究發(fā)現(xiàn),飛燕草素能誘導(dǎo)小鼠成纖維細胞產(chǎn)生保護性自噬;饑餓狀態(tài)誘導(dǎo)的自噬能通過維持氮循環(huán)促進細胞存活,降低乳腺癌患者生存期;體外3D培養(yǎng)顯示,腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中,腫瘤細胞可通過自噬途徑而存活。m TOR和AMPK信號通路作為調(diào)節(jié)細胞自噬的兩條經(jīng)典途徑,與細胞生長和能量代謝密切相關(guān),低氧狀態(tài)活化AMPK或抑制m TOR受體誘導(dǎo)的自噬能促進乳腺癌細胞存活,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑可通過抑制AKT/m TOR活性誘導(dǎo)自噬。因而,飛燕草素對HER-2受體陽性乳腺癌是否發(fā)揮抑制作用,以及自噬通過m TOR和AMPK通路在其中是否發(fā)揮重要作用,值得研究。目的在課題組前期研究基礎(chǔ)上進一步探討飛燕草素對HER-2受體陽性乳腺癌細胞的抑制效應(yīng),以及自噬在其中發(fā)揮的作用,明確飛燕草素抗HER-2受體陽性乳腺癌作用,從細胞應(yīng)答自噬的角度為HER-2受體陽性乳腺癌的防治提供新措施。材料與方法以MDA-MB-453細胞(HER-2+)為研究對象,不同濃度的飛燕草素處理細胞:(1)增殖能力:CCK8方法;(2)細胞凋亡:TUNEL法;(3)凋亡起始調(diào)控蛋白caspase-3/9的活性:Western Blot法;(3)自噬鑒定:透射電子顯微鏡檢測細胞內(nèi)自噬泡,GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染檢測自噬標志蛋白LC3-II,免疫熒光實驗檢測LC3-I/II蛋白聚集,Western Blot檢測自噬標志蛋白LC3-II、自噬體膜調(diào)控蛋白Atg5-Atg12的活性。(4)飛燕草素誘導(dǎo)MDA-MB-453細胞自噬的分子機制:Western Blot檢驗m TOR信號通路蛋白(AKT/p-APK、m TOR/p-m TOR、p70s6k/p-p70s6k、e IF4e/p-e IF4e)和AMPK信號通路蛋白(ULK1/p-ULK1、LKB1/p-LKB1、AMPK/p-AMPK、FOXO3a/p-FOXO3a)的表達或活性。(5)自噬抑制效應(yīng)的檢測:自噬早期抑制劑3-MA(5 mmol/L)預(yù)處理細胞2.5 h,再以80μmol/L的飛燕草素處理48 h,GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染檢測熒光蛋白LC3-II,免疫熒光實驗檢測細胞內(nèi)LC3-I/II蛋白聚集,Western Blot實驗檢測細胞內(nèi)LC3-I/II蛋白;CCK8實驗檢測細胞增殖活性;TUNEL實驗檢測細胞凋亡。結(jié)果(1)飛燕草素能有效抑制HER-2受體陽性型乳腺癌MDA-MB-453細胞增殖;增加TUNEL凋亡細胞數(shù);上調(diào)裂解的caspase-3/9蛋白表達。(2)飛燕草素增加GFP-LC3熒光斑點數(shù);LC3蛋白免疫熒光表達;自噬泡形成;LC3-I/II蛋白轉(zhuǎn)化;自噬體膜調(diào)控蛋白Atg5-Atg12表達。(3)飛燕草素下調(diào)m TOR通路中AKT、m TOR、e IF4E和p70s6k蛋白的活性;上調(diào)AMPK通路中LKB1、AMPK、FOXO3a與ULK1蛋白的磷酸化水平。(4)3-MA抑制GFP-LC3熒光斑點形成和LC3-I/II蛋白轉(zhuǎn)化;自噬抑制促進MDA-MB-453細胞增殖抑制和凋亡效應(yīng)。結(jié)論飛燕草素能有效抗HER-2受體陽性型MDA-MB-453乳腺癌細胞增殖,促進細胞caspase-3/9依賴性凋亡,同時誘導(dǎo)保護性自噬;飛燕草素通過抑制m TOR通路和激活A(yù)MPK通路誘導(dǎo)HER-2受體陽性型MDA-MB-453乳腺癌細胞自噬;抑制自噬能增敏飛燕草素抗HER-2受體陽性型MDA-MB-453乳腺癌細胞效應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：成都醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

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本文編號：1604541