本文選題：miR-144　切入點：肺癌　出處：《鄭州大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景和目的原發(fā)性肺癌是目前世界上死亡率最高的腫瘤性疾病,按組織學分類可分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)兩大類,后者的比例占到80%。肺癌預后不良,其5年生存率僅約為15%。近年來靶向治療成為肺癌研究最多的新的治療方案,因此進一步研究肺癌的發(fā)生及發(fā)展、侵襲機制,探索新的基因治療靶點以用于肺癌的早期診斷和個體化治療,對攻克肺癌目前高死亡率的難題有著深遠的意義。miRNAs通常是18~22nt長的、內源性、并且不編碼的RNA,它能夠與其靶基因的mRNA發(fā)生特異性結合從而影響其轉錄和翻譯功能。在人類等哺乳動物當中,miRNAs參與調控大約50%以上的基因蛋白的編碼活動。miRNAs通常作用于mRNA 3’端和5’的非翻譯區(qū)(3’UTR區(qū),5’UTR區(qū)),通過與靶基因的seed region之間的結合與作用進而發(fā)揮其調控功能。目前多數(shù)研究表明miRNAs參與各種生物過程的調控,并在其中起到非常重要的作用,其中包括衰老和一些疾病如惡性腫瘤等等的發(fā)展。miR-144最早被認定為是由成熟的紅細胞系分化得來的。除此以外,miR-144可以通過直接調節(jié)細胞應對氧化應激反應的中樞調節(jié)器官增加貧血的程度以及減少谷胱甘肽再生和抗氧化能力。在腫瘤研究中,一個關于miRNAs的表達的微陣列數(shù)據(jù)的meta分析提示:miR-144在肝癌細胞、肺癌和前列腺癌中呈低表達狀態(tài)。另有研究結果提示,上調miR-144的表達可促進宮頸癌細胞的增殖。以上結果均表明,miR-144可能是一個與人癌癥相關的一個miRNA。但是,對于miR-144高表達在肺癌中的作用機制尚不明確,需要進一步研究和探討。本研究計劃包含以下三部分:第一部分:肺癌組織中miR-144和TIGAR的表達情況及與肺癌患者臨床特征之間的相關性分析;第二部分:上調miR-144表達對肺癌H460和A549細胞株多種生物學的影響;第三部分:分析miR-144對TIGAR的初步調控機制。第一部分肺癌組織中miR-144和TIGAR表達水平及與患者臨床特征間的相關性的分析方法1.標本收集:67例術后切除的肺癌及相應癌旁組織標本。2.qRT-PCR技術用來檢測67例標本中miR-144和TIGAR mRNA相對表達水平。3.Western-blot檢測各樣本中TIGAR蛋白相對表達量。4.分析miR-144和TIGAR mRNA的表達水平與肺癌患者的年齡、性別、吸煙與否、腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移情況、TNM分期之間的相關性。5.應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析,符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以(x±s)表示;單因素方差分析用于同時具備正態(tài)性及方差齊性數(shù)據(jù)的多項指標間的比較,LSD-t檢驗用于多組數(shù)據(jù)的兩兩比較;t檢驗用于兩獨立樣本計量資料的比較,配對t檢驗用于兩配對樣本計量資料的比較;Pearson相關分析用來分析兩變量之間的相關性,設定檢驗水準α=0.05。結果1.qRT-PCR檢測顯示miR-144的相對表達水平在肺癌組織中較癌旁組織顯著降低(P0.05),且和TIGAR mRNA的相對表達水平呈負相關(R2=0.6627)。2.肺癌組織中miR-144的相對表達水平與患者的腫瘤大小、TNM分期以及淋巴結轉移情況相關(P0.05)。第二部分上調miR-144表達對肺癌H460和A549細胞株生物學行為的影響方法1.制備、包裝p GV-miR-144慢病毒載體。2.慢病毒載體感染H460和A549細胞株,篩選出可以穩(wěn)定表達的細胞株,運用qRT-PCR檢測慢病毒感染后H460和A549細胞中miR-144表達。3.按miR-144、miR-NC感染情況分別將實驗細胞分為miR-144組,Scramble組和Blank組。4.CCK-8、克隆形成實驗用來檢測細胞的增殖能力。5.流式細胞術、Caspase-3/7、Hoechst染色檢測各組細胞凋亡能力。6.MDC染色檢測各組細胞的自噬能力。7.裸鼠移植瘤實驗檢測上調miR-144的表達對肺癌A549裸鼠成瘤能力的影響。結果1.成功制備及包裝miR-144慢病毒載體,miR-144在感染的H460和A549細胞內的相對表達量較Scramble組和Blank組顯著升高(P0.05)。2.CCK-8結果顯示miR-144組細胞吸光度較Scramble組和Blank組顯著減少�？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示miR-144組較Scramble組和Blank組的細胞克隆形成數(shù)顯著降低,差異具有顯著性(P0.05)。3.流式細胞術和Hoechst染色檢測結果顯示miR-144組細胞凋亡百分比較Scramble組和Blank組顯著升高,miR-144組Caspase-3/7細胞活性較Scramble組和Blank組顯著升高,差異具有顯著性(P0.05)。4.MDC染色結果顯示miR-144組的細胞熒光強度較Scramble組和Blank組顯著升高(P0.05)。5.裸鼠移植瘤實驗結果表明miR-144組的成瘤能力顯著低于Scramble組和Blank組(P0.05)。第三部分miR-144對TIGAR表達調控機制的初步研究方法1.運用miRNA的靶基因預測數(shù)據(jù)庫對miR-144的靶基因進行預測。2.構建pmir GLO-w-TIGAR、pmir GLO-mut-TIGAR重組載體。運用雙報告基因驗證miR-144的靶基因。3.構建無3’UTR區(qū)的pc DNA3.1-TIGAR表達載體,回復實驗分析miR-144對A549細胞生物學作用的調控。4.設計并合成siRNA序列可靶向作用于TIGAR,并分si-TIGAR組、miR-144組、Blank組轉染至A549細胞。運用CCK-8法和克隆形成實驗檢測各組細胞增殖能力,流式細胞術檢測各組細胞的凋亡能力,MDC染色檢測各組細胞的自噬能力,Western blotting檢測自噬相關蛋白的表達水平。結果1.生物信息學軟件分析預測miR-144的靶基因可能為TIGAR2.雙報告基因結果表明,miR-144可以結合于TIGAR的3'UTR區(qū)發(fā)揮調控作用。3.miR-144對A549細胞的抑制增殖及促進凋亡的能力可被轉染不含3’UTR區(qū)的pc DNA3.1-TIGAR重組載體后的A549細胞回復。4.A549細胞miR-144的表達上調及TIGAR表達下調均可抑制A549細胞的增殖、促進其凋亡和自噬能力。結論1.miR-144在肺癌組織中的表達水平降低,且其表達水平與患者的腫瘤大小、有無淋巴結轉移以及TNM分期有關。2.體外上調肺癌細胞中miR-144表達可抑制細胞的增殖能力,促進細胞的凋亡和自噬能力。裸鼠移植瘤實驗表明上調miR-144的表達能有效抑制肺癌細胞的成瘤能力。3.miR-144可作用于TIGAR的3’UTR區(qū)負向調控其表達,從而抑制肺癌細胞的生長、促進細胞的凋亡和自噬,還能有效抑制肺癌細胞的成瘤能力。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

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1 王露;翟瑋瑋;楊向榮;王芳;李見;張強;李玉云;;慢病毒介導RNA干擾沉默F(xiàn)as基因在臍帶間充質干細胞中的表達[J];南方醫(yī)科大學學報;2014年10期

2 朱璐;史春梅;崔焱;徐廣峰;季晨博;倪毓輝;郭錫熔;;hsa-miR-335靶基因預測及生物信息學分析[J];西部醫(yī)學;2012年10期

3 馬中良;金由辛;;微RNA與肺癌[J];生命的化學;2010年04期

4 李寧;萬文婷;金林紅;;CCK-8法和MTT法檢測人前列腺癌PC3細胞活性的最佳條件比較研究[J];貴州大學學報(自然科學版);2009年03期

5 李娜;高俊巖;劉敏;;細胞凋亡和腫瘤的關系研究進展[J];當代醫(yī)學;2009年16期

6 熊建文;肖化;張鎮(zhèn)西;;MTT法和CCK-8法檢測細胞活性之測試條件比較[J];激光生物學報;2007年05期

7 張秀英;鄧方閣;王心蕊;曲麗梅;李玉林;;Transwell侵襲小室技術的改良及其在人骨髓間充質干細胞誘導分化中的應用[J];中國免疫學雜志;2006年12期

8 王珊,李寧,于力方,廖杰;流式細胞術檢測細胞凋亡比較研究[J];標記免疫分析與臨床;2005年03期

9 劉芹,路平,華彩虹;腫瘤細胞增殖調控的研究進展[J];新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報;2004年01期

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