本文選題：甲狀腺乳頭狀癌　切入點：靶標代謝組學(xué)　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景：甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌最常見的病理類型(約占80%),近年來世界各地均出現(xiàn)甲狀腺癌的發(fā)病率持續(xù)升高的現(xiàn)象,其中尤以甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病率的上升最為明顯。研究表明,甲狀腺乳頭狀癌是一種“隋性”腫瘤,其早期診斷和及時的手術(shù)治療可以明顯改善患者預(yù)后,有效降低復(fù)發(fā)率和病死率。目前公認的甲狀腺癌的診斷方法是超聲及超聲引導(dǎo)下細針穿刺活檢(FNAB),但是超聲診斷的缺陷在于其結(jié)果依賴于檢查者的個人技術(shù)水平,而FNAB的診斷靈敏度和特異性也并不盡人意,尤其是甲狀腺微小癌(癌灶直徑1cm)的FNAB陰性預(yù)測準確率只能達到72.2%。因此有很多研究者致力于找到有效的生物標志物來輔助FNAB的診斷,提高甲狀腺癌術(shù)前診斷的準確率,避免非必要的手術(shù)治療給患者帶來的焦慮情緒和身體創(chuàng)傷。代謝組學(xué)是一種利用分析化學(xué)方法來研究一個代謝物組中小分子代謝相關(guān)物質(zhì)及其變化規(guī)律的科學(xué)。它能夠及時而全面的分析出生物系統(tǒng)在某一特定階段存在的復(fù)雜的代謝物質(zhì),并能對這些物質(zhì)進行定性以及定量的檢測,反映內(nèi)外因變化對系統(tǒng)代謝造成的影響。目前它已成為一個公認的系統(tǒng)分析平臺,可用于組織、血液、尿液等生物樣本的研究,揭示其中小分子代謝物的組成特點及變化規(guī)律。根據(jù)研究模式不同,可將代謝組學(xué)分為非靶標代謝組學(xué)和靶標代謝組學(xué)。非靶標代謝組學(xué)是從全局分析的角度將樣本中所有的代謝物質(zhì)識別出來,該研究模式的優(yōu)勢在于全面尋找有差異的代謝物,可用于診斷標志物的初步篩查；其缺點是對代謝物識別的準確性不高,可信度較低,且只能進行半定量測定。而靶標代謝組學(xué)的特點則是利用相應(yīng)的標準品對既定的一組代謝物質(zhì)進行精確的定性定量分析,其準確性和重現(xiàn)性遠高于非靶標代謝組學(xué)。兩者互相結(jié)合可以各取所長,使得代謝組學(xué)研究結(jié)果更加完善。隨著生物信息技術(shù)的發(fā)展,越來越多的平臺被開發(fā)出來用于代謝組學(xué)相關(guān)研究,包括氣相色譜-質(zhì)譜分析(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜分析(LC-MS)和核磁共振譜學(xué)分析(NMR)等。因此筆者認為代謝組學(xué)研究可以為尋找腫瘤標志物及探索腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的代謝紊亂提供新的研究方向。研究目的：我們本次研究的目的是希望利用靶標和非靶標代謝組學(xué)相結(jié)合的方式探索甲狀腺乳頭狀癌的代謝特點。首先利用氣相色譜-飛行時間-質(zhì)譜(GC-TOF-MS)平臺找到針對甲狀腺乳頭狀癌組織進行代謝組學(xué)分析的實驗方法；其次通過非靶標代謝組學(xué)的研究模式初步比較分析甲狀腺乳頭狀癌組織樣本和正常甲狀腺組織樣本,評價該方法的應(yīng)用效果,找到含量有差異的代謝物質(zhì)；進而探索出利用超高效液相色譜-三重四級桿-質(zhì)譜(UHPLC-QqQ-MS) 和 GC-TOF-MS對肌醇半乳糖苷(galactinol)和蜜二糖(melibiose)等標志物進行測定的方法。最后通過靶標代謝組學(xué)的模式進行驗證實驗,對篩選出的標志物進行精確定性和絕對定量分析,并根據(jù)定量結(jié)果分析標志物的診斷價值,以期找到可用于輔助FNAB診斷的生物標志物。從而提高甲狀腺乳頭狀癌的術(shù)前診斷準確率,使患者能夠被早診斷早治療,同時減少患有非惡性甲狀腺結(jié)節(jié)患者的過度焦慮情緒,避免不必要的手術(shù)治療。此外,我們還可以通過對受影響的代謝通路的分析,研究甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展機制,探索其潛在的治療靶點。研究方法：1.臨床樣本的收集。甲狀腺乳頭狀癌及正常甲狀腺組織來源于甲狀腺手術(shù)患者(2013.12.1-2014.12.31,山東省立醫(yī)院乳腺甲狀腺外科)的術(shù)中樣本,共收集了50個樣本,其中包括25個術(shù)后病理證實為甲狀腺乳頭狀癌組織樣本和25個正常甲狀腺組織樣本。2. 非靶標GC-TOF-MS代謝組學(xué)分析。共30個樣本(15個甲狀腺乳頭狀癌組織vs15個正常甲狀腺組織)用于非靶標代謝組學(xué)分析。通過研磨,離心,提取等步驟,將組織中的代謝物質(zhì)分離,加入內(nèi)參標準品L-2-氯苯丙氨酸后放入GC分析儀。GC分析柱中可將各組分根據(jù)分子量不同進行分離,分離出的物質(zhì)依次進入TOF-MS進行各組分的質(zhì)量(mass)和保留時間(R.T.)測定。將數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫中的代謝物信息進行比對,得出代謝物的定性及半定量結(jié)果。3. 非靶標GC-TOF-MS統(tǒng)計學(xué)分析。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過缺失值模擬,最小值二分之一法進行填補,數(shù)據(jù)過濾去噪,內(nèi)標歸一法處理后導(dǎo)入SIMCA-P+ 13.0軟件進行模式識別分析。模式識別分析方式包括主成分分析法(PCA)、偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA),另外為評估PLS-DA模型的穩(wěn)定性和預(yù)測能力我們進行了7折交叉驗證實驗。最后基于OPLS-DA模型,進行差異代謝物分析,篩選標準是變量投影重要性(VIP)大于1.0且t檢驗結(jié)果P值0.05。用于代謝物相關(guān)通路分析的數(shù)據(jù)庫是京都基因和基因組百科全書(EGG; http://www.genome.jp/kegg/)。4.靶標UHPLC-QqQ-MS分析和數(shù)據(jù)處理。共有20個樣本(10個甲狀腺乳頭狀癌組織vs 10個正常甲狀腺組織)用于靶標分析。所有的分析物標準品經(jīng)過甲醇或蒸餾水稀釋配成具有濃度梯度的標準溶液(10 ng/μl至100 ng/μl)。進入多反應(yīng)監(jiān)測系統(tǒng)(MRM)的模式(陽離子模式或陰離子模式),優(yōu)化參數(shù)去簇電壓(DP),碰撞能(CE)和碰撞通道輸出加壓值(CXP)的檢測值,選擇代謝物質(zhì)譜檢測響應(yīng)值最高的參數(shù)模式。樣本經(jīng)過預(yù)處理后進入UHPLC分析儀進行色譜分析,然后進入QqQ-MS得到最終結(jié)果。根據(jù)梯度標準品溶液測定結(jié)果繪制標準曲線,確定定量結(jié)果。T檢驗用來分析兩組間某一代謝物的統(tǒng)計學(xué)差異,另外利用R語言軟件繪制受試者工作曲線(ROC curve)來評價各個獨立的生物標志物和多個標志物聯(lián)合的診斷效果。5.靶標GC-TOF-MS分析和數(shù)據(jù)處理。所有的分析物標準品經(jīng)過甲醇或蒸餾水稀釋配成具有濃度梯度的標準溶液(10 ng/μl100 ng/μl)。與靶標UHPLC-QqQ-MS分析同樣樣本共20個(10個甲狀腺乳頭狀癌組織vs 10個正常甲狀腺組織),經(jīng)過預(yù)處理(過程與非靶標分析一樣)包括衍生化過程,進入GC分析儀,然后進入與之偶聯(lián)的TOF-MS。將待測物相關(guān)參數(shù)與相應(yīng)的標準曲線進行比對,得到最終的定量結(jié)果。統(tǒng)計學(xué)分析過程與UHPLC-QqQ-MS相同。結(jié)果：1.我們探索出利用GC-TOF-MS技術(shù)平臺對甲狀腺乳頭狀癌組織樣本進行分析的具體實驗方法,彌補了之前沒有用這一平臺進行甲狀腺癌組織樣本研究的不足。通過非靶標的GC-TOF-MS分析得到全部樣本的代謝圖譜分析結(jié)果�；谏V分析過程,我們得到所有樣本的總離子色譜圖(TICs),圖中的各個色譜峰沒有漂移現(xiàn)象證明了各組分在色譜柱中保留時間的穩(wěn)定性。全部樣本分析后,共有761個色譜峰被識別出來,去除噪音數(shù)據(jù)后最終得到686個代謝物信息。2.統(tǒng)計學(xué)模式識別分析發(fā)現(xiàn)GC-TOF-MS可以將甲狀腺乳頭狀癌樣本和正常甲狀腺組織樣本區(qū)別開。首先,PCA計算的結(jié)果是R2X=0.427、Q2=0.159,PCA得分圖結(jié)果表明所有的樣本都可以被清晰地區(qū)分,且無不相關(guān)的離群樣本。其次,針對某些樣本沒能被清楚分組的情況,我們采取有監(jiān)督的方式對數(shù)據(jù)進行分析,PLS-DA模型計算的結(jié)果是R2X=0.225和R2Y=0.944,證明了該模型中數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和模型參數(shù)的高度適應(yīng)性,得分圖顯示出兩組樣本區(qū)分明顯。同時對PLS-DA模型進行7折交叉排列驗證實驗,結(jié)果排除了該模型中數(shù)據(jù)的隨機效應(yīng)。最后,我們用OPLS-DA模型將癌組織組和正常組精確區(qū)分開來,結(jié)果R2X=0.225, R2Y=0.944, Q2Y= 0.687,這表明該組數(shù)據(jù)的差別主要來自組間的差異。3.統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)組間含量有差異的代謝物共45個,與之相關(guān)的受疾病影響的代謝通路有15個�；贠PLS-DA模型,我們篩選癌組織組和正常組之間含量有差異的代謝物,標準是VIP值1且P值0.05。差異倍數(shù)較明顯的代謝物包括α-氨基乙二酸(alpha-aminoadipic acid;差異倍數(shù)(FC)=20.05),α-亞麻酸(a-linolenic acid; FC=4.176)等。通過KEGG數(shù)據(jù)庫匹配到的受影響的代謝通路中,半乳糖代謝(Galactose metabolism)是受影響最大的代謝通路,其包含的差異代謝物數(shù)量最多,包括葡萄糖(Glucose).山梨醇(Sorbito 1).肌醇半乳糖苷(Galactinol)和蜜二糖(Melibiose)。其他受影響的代謝通路還包括賴氨酸降解(Lysine degradation),配體受體神經(jīng)信號傳導(dǎo)通路(Neuroactive ligand-receptor interaction),嘧啶代謝(Pyrimidine metabolism),不飽和脂肪酸的合成(Biosynthesis of unsaturated fatty acids)以及雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(Two-component system)。參與這些通路的差異代謝物包括油酸(Oleic acid)、去甲腎上腺素(Noradrenaline)、花生酸(Arachidic acid)、α-氨基乙二酸(alpha-Aminoadipic acid)、戊二酸(Glutaric acid)、α-α-亞麻酸(Linolenic acid)、尿甘(Uridine)、5,6-二氫尿嘧啶(5,6-Dihydrouracil)和褪黑素(Melatonin)共9個。與半乳糖代謝通路中的4個代謝物結(jié)合起來共13個代謝物進入后續(xù)靶標代謝組學(xué)研究。4.靶標代謝組學(xué)實驗驗證出11個代謝物質(zhì),經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析,其中3個可作為潛在診斷標志物。我們構(gòu)建了標準曲線用于待驗證代謝物質(zhì)的定量分析,除glucose, glutaric acid 和 noradrenaline以外,其它的標準曲線的參數(shù)R2均大于0.98。除去noradrenaline 和 5,6-dihydrouracil以外,共有11個代謝物質(zhì)在樣本中得到驗證,即它們具有較高的被測靈敏度及檢測可重復(fù)性。經(jīng)過t-檢驗,我們發(fā)現(xiàn)只有參與galactose metabolism通路的galactinol, melibiose和參與neuroactive ligand-receptor interaction通路的melatonin在甲狀腺乳頭狀癌組織和正常甲狀腺組織之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),可以作為診斷標志物進行后續(xù)研究。5.將galactinol, melibiose 和 melatonin作為聯(lián)合標志物對于甲狀腺乳頭狀癌的診斷效率最高。我們構(gòu)建ROC曲線計算曲線下面積(AUC)以研究三個標志物的診斷效果。首先,分別構(gòu)建三個標志物的ROC曲線,發(fā)現(xiàn)無論是利用非靶標的半定量數(shù)據(jù)還是靶標實驗的定量數(shù)據(jù),除galactinol以外,其他兩個指標的AUC值均小于0.9。其次,我們將三個指標聯(lián)合起來研究,基于非靶標數(shù)據(jù)顯示聯(lián)合標志物的診斷靈敏度為93.3%,特異性為100%,AUC值為0.95。通過分析靶標實驗的數(shù)據(jù),進一步證明了聯(lián)合標志物診斷的優(yōu)勢：靈敏度90.0%,特異性100%,AUC值0.96。6. Galactose metabolism通路參與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展過程。為了分析與甲狀腺乳頭狀癌相關(guān)性最大的代謝通路,我們利用Metabo Analyst 2.0 (http://www.metaboanalyst.ca/Metabo Analyst/)分析差異代謝物,數(shù)據(jù)表明半乳糖代謝通路的影響值為0.1,即該代謝通路顯著影響乳頭狀癌的腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。通過KEGG數(shù)據(jù)庫中的半乳糖代謝通路圖,我們發(fā)現(xiàn)α-半乳糖苷酶(GLA)是影響半乳糖代謝的關(guān)鍵酶之一。同時,我們的實驗結(jié)果證明通路中的甘露糖(mannose), sorbitol, galactinol, melibiose 和 glucose均是GLA對半乳糖進行分解得到的產(chǎn)物,且它們的含量在癌組織中均較低。因此,我們推測甲狀腺乳頭狀癌組織中GLA的活性降低或受到抑制可能是相關(guān)降解產(chǎn)物含量降低的原因,通過改變它的活性也可能成為甲狀腺乳頭狀癌后續(xù)治療研究中的有效靶點。結(jié)論：1.本次研究首次探索出非靶標和靶標代謝組學(xué)聯(lián)合研究甲狀腺乳頭狀癌輔助診斷標志物的方法。這種篩選加驗證的方法對標志物進行精確定性和定量分析,使篩選出的標志物具有更高的準確性和可重復(fù)性,有效提高了其臨床應(yīng)用價值。這是首次將靶標代謝組學(xué)的方法應(yīng)用于甲狀腺癌標志物研究。2.本次研究創(chuàng)造性得探索出利用非靶標GC-TOF-MS和靶標GC-TOF-MS, UHPLC-QqQ-MS平臺對甲狀腺乳頭狀癌組織樣本進行分析的具體實驗方法。并且證明了GC-TOF-MS平臺可用于甲狀腺乳頭狀癌組織樣本和正常組織樣本的判別診斷。3.代謝物圖譜易受機體內(nèi)外多方面因素的影響,是代謝組學(xué)分析的特征之一,本次研究專門針對甲狀腺乳頭狀癌這一最常見甲狀腺癌病理學(xué)類型進行分析,可以排除由于病理類型不同而對代謝圖譜造成的干擾。利用組織樣本進行研究可以最直接得反映病灶本身代謝相關(guān)變化,為腫瘤形成機制的研究提供可靠線索。4.由于代謝系統(tǒng)的復(fù)雜性,我們特別提出利用聯(lián)合標志物輔助甲狀腺乳頭狀癌診斷。通過我們的研究,galactinol,melibiose 和 melatonin三種代謝物作為聯(lián)合標志物被提出來用于輔助診斷。5.代謝物富集分析得出的受影響的代謝通路的結(jié)果提示影響甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展的因素。Galactose metabolism通路作為人體能量代謝的一部分在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。我們提出該通路中的關(guān)鍵酶的GLA可能作為新的治療靶點用于今后的研究。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R736.1
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本文編號：1602431