發(fā)布時間：2018-03-09 17:02

  本文選題：微顆粒　切入點：溶瘤腺病毒　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：溶瘤病毒是一種經(jīng)過基因改造的病毒,可以特異性地在腫瘤細胞中大量復制并殺傷腫瘤細胞。利用溶瘤病毒治療惡性腫瘤是腫瘤生物療法的主要策略之一,目前已有多種病毒被改造成溶瘤病毒,并得到快速發(fā)展。然而,溶瘤病毒具有很強的免疫原性,容易被機體的免疫監(jiān)視系統(tǒng)識別并中和,導致溶瘤病毒難以到達腫瘤部位殺傷腫瘤細胞。但現(xiàn)有的一些溶瘤病毒載體,比如具有趨瘤性的細胞或人工合成的納米材料,其效果并不理想,一些載體還存在著安全隱患。因此,亟待研發(fā)新型載體攜帶溶瘤病毒并靶向腫瘤細胞。我們課題組前期工作顯示腫瘤細胞來源的微顆粒(Tumor cell-derived microparticles, T-MPs) (直徑為100-1000 nm)可以包裹化療藥物并有效殺傷腫瘤細胞。而T-MPs是否能夠包裹溶瘤腺病毒,作為運輸溶瘤腺病毒的新型載體則不清楚。因此,我們提出假設：T-MPs的直徑明顯大于溶瘤腺病毒的直徑(90～100nm),有可能成為包裹并運輸溶瘤腺病毒的載體。為驗證這一設想,本課題著重從以下三個方面進行研究：首先,檢測T-MPs是否能夠包裹溶瘤腺病毒。選用人肺癌細胞A549細胞提取包裹溶瘤腺病毒的微顆粒OA-MPs (Oncolytic adenovirus contained microparticles, OA-MPs);利用透射電子顯微鏡分析單個OA-MP的形態(tài),以粒徑分布分析技術和流式分析技術檢測OA-MPs群體的直徑分布狀況,由此證實所提取的OA-MPs樣本符合微顆粒的質量要求；再用PCR (Polymerase chain reaction, PCR)分析OA-MPs的成分,并采用雙光子顯微鏡技術對T-MPs與溶瘤腺病毒進行共定位分析。結果證明OA-MPs可以包裹溶瘤腺病毒。其次,清除OA-MPs中游離的溶瘤腺病毒顆粒,對OA-MPs進行純化后用于體外和體內(nèi)實驗,檢測DA-MPS是否能有效殺傷腫瘤細胞。對于體外實驗,將OA-MPs與多種腫瘤細胞共同培養(yǎng),觀察腫瘤細胞生長變化情況,結果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比,OA-MPs組的腫瘤細胞凋亡增多；對于體內(nèi)實驗,通過建立裸鼠皮下、腹腔腫瘤模型,觀察并比較對照組、溶瘤腺病毒組以及OA-MPs組的腫瘤大小、腫瘤重量及小鼠長期存活率。結果顯示,與對照組和溶瘤腺病毒組相比,OA-MPs組的小鼠長期存活率明顯提高,其腫瘤生長受到明顯抑制。最后,為進一步驗證T-MPs是否可以躲避中和抗體,作為攜帶溶瘤腺病毒的有效載體,本課題通過PCR技術、流式檢測技術、電子顯微鏡技術、雙光子顯微鏡檢測技術、三維纖維蛋白軟凝膠篩選干細胞技術,并建立動物皮下腫瘤以及腹腔腫瘤模型,對OA-MPs組與溶瘤腺病毒組殺傷腫瘤細胞的效果進行比較分析。結果發(fā)現(xiàn)：與空白對照組及溶瘤腺病毒組相比,OA-MPs殺傷腫瘤細胞具有以下特點：(1)OA-MPs可保護溶瘤腺病毒不被特異性中和抗體識別,并使溶瘤腺病毒有效殺傷腫瘤細胞；(2)OA-MPs可以介導其包裹的溶瘤腺病毒更快進入細胞核,使溶瘤腺病毒更快殺傷腫瘤細胞；(3)OA-MPs不依賴柯薩奇病毒腺病毒受體(Coxsackievirus and adeno virus receptor, CAR)介導溶瘤腺病毒進入細胞,因此對于CAR表達下調的腫瘤細胞依然具有殺傷作用；(4)OA-MPs能有效地抑制三維纖維蛋白軟凝膠篩選出來的干細胞樣腫瘤細胞的生長(Stem-like tumor-repopulating cells, TRC)。本研究利用T-MPs作為攜帶溶瘤腺病毒的載體,并通過體內(nèi)外實驗檢測了T-MPs攜帶溶瘤腺病毒殺傷腫瘤細胞的特點與優(yōu)勢,為其潛在的臨床應用提供了理論基礎。
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【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R730.5
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本文編號：1589435