發(fā)布時間：2018-03-01 15:42

  本文關(guān)鍵詞： 多發(fā)性骨髓瘤 E3連接酶 硼替佐米 耐藥 Pirh2　出處：《浙江大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景： 多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一種單克隆漿細胞異常增生的惡性腫瘤,可引起骨病變、腎功能受損、貧血等臨床癥狀和多器官功能障礙,其發(fā)病率已居血液系統(tǒng)惡性腫瘤第二位。MM在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,嚴重威脅國民的生活和健康。蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib,Bor)是目前治療MM的最有效藥物之一,以其為基礎(chǔ)的化療方案治療MM患者總體有效率高達80-90%,但原發(fā)及繼發(fā)性耐藥是Bor治療MM失敗的主要原因,嚴重影響B(tài)or的療效。因此進一步探究MM耐藥機制,尋找克服Bor耐藥的方法,是臨床上亟待解決的關(guān)鍵問題。泛素-蛋白酶體途徑是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要方式,這種蛋白質(zhì)降解途徑在時間和空間上精確調(diào)控胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)含量,其中E3泛素連接酶決定蛋白質(zhì)降解的特異性。近年來,越來越多的證據(jù)表明,泛素-蛋白酶體途徑相關(guān)組分的異常,特別是決定泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解蛋白特異性的E3連接酶的異常,和腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及藥物耐藥密切相關(guān),在維持MM細胞生長生存中亦發(fā)揮關(guān)鍵性作用。因此,深入研究E3連接酶在MM發(fā)生發(fā)展及耐藥中的作用,對尋求臨床治療新靶點,判斷預(yù)后有著重要意義。Pirh2是新發(fā)現(xiàn)的E3連接酶,最早被認為可協(xié)同雙微體基因HDM2癌蛋白發(fā)揮調(diào)節(jié)p53的作用,受p53誘導(dǎo)激活并調(diào)控p53。近年隨著研究的深入,能夠和Pirh2相互作用的底物蛋白被逐漸發(fā)現(xiàn),研究證實Pirh2與惡性腫瘤發(fā)生及預(yù)后相關(guān),Pirh2可根據(jù)其底物特異性,既發(fā)揮促進腫瘤的作用,也可以抑制腫瘤發(fā)生,在不同類型腫瘤中發(fā)揮不同的作用。已有文獻報道Pirh2參與漿細胞的增殖調(diào)控,而我們前期研究通過基因表達譜芯片發(fā)現(xiàn)Pirh2在MM Bor耐藥細胞株中表達降低。值得關(guān)注的是究竟Pirh2在血液系統(tǒng)惡性腫瘤MM Bor耐藥中是否發(fā)生作用,是否可作用于相關(guān)底物蛋白,從而介導(dǎo)Bor耐藥及其具體機制仍未可知。遂本實驗在此基礎(chǔ)上,深入研究E3連接酶Pirh2在MM Bor耐藥中的作用及其機制。 研究目的： 1.明確MM中,Pirh2與Bor耐藥的關(guān)系,同時構(gòu)建Bor耐藥細胞株模型進一步研究Pirh2在Bor耐藥中的作用; 2.構(gòu)建Pirh2敲除及過表達的慢病毒載體轉(zhuǎn)染MM細胞,探討Pirh2對MM細胞生物學行為的影響,揭示Pirh2在MM中的角色,并研究其具體機制； 3.探究MM細胞中可能與Pirh2相互作用的底物蛋白,從而介導(dǎo)Bor耐藥。初步研究Pirh2在MM細胞中參與哪些蛋白的泛素化調(diào)控。 研究方法： 1.利用免疫熒光、Western blot、RT-PCR技術(shù)分別檢測Pirh2在MM細胞株RPMI8226、ARP-1、ARK、MM1S、MM1R、NCI-H929、LP-1和OPM-2中的表達情況,并比較Pirh2在新診斷和難治復(fù)發(fā)MM患者(骨髓CD138+細胞)中的表達差異；同時濃度遞增法建立Bor耐藥細胞株NCI-H929.BR,并在耐藥株中觀察Pirh2的表達變化； 2.用慢病毒載體構(gòu)建Pirh2敲除及過表達的MM細胞,利用CCK-8法、流式細胞分析術(shù)測定Pirh2敲除及過表達對骨髓瘤細胞增殖、周期及凋亡的影響。在此基礎(chǔ)上加用Bor觀察其療效改變,Western blot進一步檢測Pirh2敲除及過表達后相關(guān)蛋白的改變； 3.免疫共沉淀Co-IP技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析尋找MM細胞中可能與Pirh2相互作用的底物蛋白； 4.基因表達譜芯片篩選Bor耐藥細胞和親本細胞基因表達差異,同時對Pirh2敲除、Pirh2過表達及對照組細胞進行基因表達譜芯片篩查,結(jié)合Co-IP及質(zhì)譜分析結(jié)果,探尋受Pirh2調(diào)控并在Bor耐藥中發(fā)揮作用的關(guān)鍵因子； 5.構(gòu)建MM荷瘤小鼠模型,皮下注射Pirh2敲除、過表達及對照組MM細胞ARP-1-Pirh2,ARP-1-ctl,NCI-H929-kd、NCI-H929-ctl構(gòu)建MM移植瘤NOD/SCID小鼠模型,在體內(nèi)驗證Pirh2對骨髓瘤細胞的作用。 研究結(jié)果： 1. Western blot、RT-PCR結(jié)果顯示Pirh2在MM細胞株RPMI8226、ARP-1、ARK、 MM1S、MM1R、NCI-H929、LP-1和OPM-2中均表達,其中在ARK、ARP-1和LP-1細胞株中相對低表達,免疫熒光結(jié)果顯示Pirh2在上述MM細胞中以胞漿表達為主。RT-PCR檢測結(jié)果顯示Pirh2在原代MM細胞(患者骨髓CD138+細胞)中也存在表達,其中難治復(fù)發(fā)患者Pirh2表達低于新診斷未治療的MM患者(p0.05)： 2.采用濃度遞增法自骨髓瘤細胞系NCI-H929成功建立Bor耐藥株NCI-H929.BR,持續(xù)刺激6個月,CCK-8法檢測Bor對親本NCI-H929和NCI-H929.BR24h的IC50,分別為17.62±1.92nmol/L和234.30±6.02nmol/L,耐藥倍數(shù)為13.30(P0.05)。生長曲線及流式細胞分析術(shù)結(jié)果顯示NCI-H929親本和NCI-H929.BR的生長曲線和細胞周期分布無顯著性差異(P0.05)； 3. Western blot檢測Bor耐藥株NCI-H929.BR建立過程中Pirh2蛋白表達變化,結(jié)果提示在Bor的反復(fù)刺激下,隨著耐藥株建立的時間推移,Pirh2蛋白表達逐漸降低。在RPMI8226、RPMI8226.BR和OPM-2、OPM-2.BR細胞株中也得到同樣結(jié)果； 4.MM細胞未予Bor處理時,Pirh2敲除或者過表達對MM細胞的周期、增殖、凋亡影響不明顯(P0.05)； 5.Pirh2敲除可降低MM細胞對Bor敏感性,且細胞G1期阻滯明顯降低。流式細胞分析術(shù)結(jié)果顯示RPMI8226-kd、RPMI8226-ctl G1期比例分別為39.03±3.20%vs52.84±2.89%。OPM-2-kd、OPM-2-ctl G1期比例分別為42.40±5.84%vs57.00±6.23%。NCI-H929-kd、NCI-H929-ctl G1期比例分別為23.37±2.12%vs42.91±1.89%,和對照組相比,Pirh2敲除后Bor誘導(dǎo)的細胞G1期阻滯明顯降低(p0.05)。CCK-8法檢測細胞增殖結(jié)果顯示敲除Pirh2后,Bor抑制細胞增殖能力減弱。AnnexinV凋亡分析顯示與對照組相比,敲除Pirh2組Bor誘導(dǎo)細胞凋亡減低。RPMI8226-kd、RPMI8226-ctl凋亡率分別為47.90±1.63%vs55.60±2.86%;OPM-2-kd、OPM-2-ctl凋亡率分別為48.30±1.17%vs63.60±1.24%;NCI-H929-kd、NCI-H929-ctl凋亡率分別為20.28±0.98%vs38.37±1.34%,Pirh2敲除后Bor誘導(dǎo)的細胞凋亡明顯減少(p0.05)； 6.Pirh2過表達可增加MM細胞對Bor敏感性,且細胞G1期阻滯明顯增加。ARP-1-Pirh2、ARP-1-ctl G1期比例分別為51.56±3.91%vs40.88±2.09%。ARK-Pirh2、ARK-ctl G1期比例分別為49.10±4.32%vs31.90±3.98%。LP-1-Pirh2、LP-1-ctl G1期比例分別為58.90土4.06%vs32.40±2.76%,和對照組相比,Pirh2過表達后Bor誘導(dǎo)的細胞G1期阻滯明顯增加(p0.05)。CCK-8法檢測細胞增殖結(jié)果顯示Pirh2過表達后,Bor抑制細胞增殖能力增強。凋亡分析顯示,加用Bor處理24h后,與對照組相比,Pirh2組Bor誘導(dǎo)細胞凋亡增加。ARP-1-Pirh2、ARP-1-ctl凋亡率分別為66.90±3.73%vs41.70±1.86%。ARK-Pirh2、ARK-ctl凋亡率分別為76.80±4.17%vs66.60±3.24%。LP-1-Pirh2、LP-1-ctl凋亡率分別為22.02±1.23%vs15.53±2.03%,和對照組相比,Pirh2過表達細胞Bor誘導(dǎo)細胞凋亡增加(p0.05)。 7. Western blot結(jié)果顯示Pirh2敲除細胞株RPMI8226-kd、OPM-2-kd及NCI-H929-kd c-myc和p53表達水平增加,而Pirh2過表達細胞株ARP-1-Pirh2、ARK-Pirh2、 LP-1-Pirh2c-myc和p53表達水平降低。在Pirh2敲除或過表達的MM細胞中,HDAC1、Tip60、USP28等蛋白水平均無明顯改變； 8.小鼠荷瘤實驗證實Pirh2對皮下成瘤能力無明顯影響,但Pirh2敲除后腫瘤組織c-myc表達水平增加。而Pirh2過表達后腫瘤組織c-myc表達水平降低； 9.免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析鑒定Pirh2相互作用蛋白,結(jié)果提示Pirh2可能與代謝相關(guān)的蛋白DLAT、PDHX、PDHA1、PDHB,E3連接酶TRIM21及核糖體蛋白RPL13、RPL10等相互作用,基因芯片結(jié)果顯示其中TRIM21、RPL13在骨髓瘤Bor耐藥細胞中表達明顯降低,提示其在MM細胞中可能參與Bor敏感性的調(diào)控,但仍需進一步研究證實。 結(jié)論： 1.骨髓瘤細胞Pirh2低表達和Bor耐藥相關(guān),Pirh2在MM細胞株RPMI8226、ARP-1、 ARK、MM1S、MM1R、NCI-H929、LP-1和OPM-2中普遍表達,其中在ARK、ARP-1和LP1細胞株中相對低表達；Pirh2在難治復(fù)發(fā)MM患者中表達低于新診斷未治療患者,成功構(gòu)建Bor耐藥細胞株,并證實Pirh2在耐藥株中表達下調(diào)； 2.Pirh2敲除或過表達對MM細胞本身增殖及細胞周期無明顯影響,Pirh2敲除細胞株RPMI8226-kd、OPM-2-kd及NCI-H929-kd對Bor敏感性降低,而Pirh2過表達細胞株ARP-1-Pirh2、APK-Pirh2、LP-1-Pirh2對Bor敏感性增強； 3.Pirh2可通過c-myc、p53介導(dǎo)Bor誘導(dǎo)的細胞增殖、凋亡和周期調(diào)控,介導(dǎo)Bor耐藥; 4.免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析鑒定Pirh2相互作用蛋白,結(jié)果提示Pirh2可能與代謝相關(guān)的蛋白DLAT、PDHX、PDHA1、PDHB,E3連接酶TRIM21及核糖體蛋白RPL13、RPL10等相互作用,基因芯片結(jié)果顯示其中TRIM21、RPL13在骨髓瘤Bor耐藥細胞中表達明顯降低,提示其在MM細胞中可能參與Bor敏感性的調(diào)控,但仍需進一步研究證實。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R733.3

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本文編號：1552586