本文關(guān)鍵詞： ABCB1 ABCG2 肝再生增強(qiáng)因子 肝細(xì)胞癌 多藥耐藥性　出處：《首都醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景與目的:肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第五大最常見(jiàn)惡性腫瘤,而其致死率在惡性腫瘤中居于第三位。更為嚴(yán)峻的是,HCC患病率仍呈逐年上升趨勢(shì)。近年來(lái),由于影像學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展,HCC早期診斷率較過(guò)去顯著提升,但其治療效果依舊未能很好解決。根據(jù)腫瘤分期,HCC的治療手段主要分為手術(shù),放療及化療。由于HCC對(duì)多種化療藥物具有固有的多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR),使其化療效果一直不盡如人意。肝再生增強(qiáng)因子(augmenter of liver regeneration,ALR),又稱肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS),最初被報(bào)道發(fā)現(xiàn)于肝部分切除術(shù)后的大鼠肝臟中,可以刺激肝臟再生。實(shí)驗(yàn)室及臨床研究均證實(shí)ALR與多種肝臟疾病密切相關(guān)。近期發(fā)現(xiàn),在肝硬化、膽管細(xì)胞癌及HCC患者的肝組織中,ALR基因及蛋白表達(dá)水平均呈升高態(tài)勢(shì)。另外,有報(bào)道稱在HCC患者中,ALR表達(dá)量與其腫瘤分級(jí)及轉(zhuǎn)移性呈負(fù)相關(guān)。盡管已經(jīng)有大量研究證明,HCC高轉(zhuǎn)移特點(diǎn)與耐藥性密切相關(guān),但迄今,有關(guān)ALR是否與HCC耐藥有關(guān)仍不甚明了。而本實(shí)驗(yàn)研究目的旨在探明ALR表達(dá)與HCC耐藥性之關(guān)系并試圖探究其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:1.為確信ALR表達(dá)與HCC耐藥性之關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)中使用了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ALR基因的HepG2細(xì)胞系(ALR-tx)及穩(wěn)定敲減ALR基因的HepG2細(xì)胞系(ALR-sh RNA),并采用HepG2野生型細(xì)胞系Mock及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體的HepG2細(xì)胞系Vector-tx作為對(duì)照。以上細(xì)胞用不同劑量抗腫瘤藥物---阿霉素(doxorubicin,0、0.5、1、2、4、8及16μg/ml)處理48 h后,測(cè)定細(xì)胞存活情況并計(jì)算半數(shù)抑制劑量(IC_(50))。并應(yīng)用克隆抑制實(shí)驗(yàn)測(cè)定單個(gè)細(xì)胞藥物處理后的增殖潛力。為進(jìn)一步證實(shí)ALR基因表達(dá)與抗腫瘤效果的關(guān)系是否具有細(xì)胞特異性,本實(shí)驗(yàn)采用其他HCC細(xì)胞系(Bel-7402,Hep3B和Huh7),觀察ALR轉(zhuǎn)染與阿霉素引起的腫瘤生長(zhǎng)抑制的關(guān)系。2.為進(jìn)一步證實(shí)ALR與HCC耐藥相關(guān),本實(shí)驗(yàn)建立了裸鼠荷瘤模型。在NOD/SCID小鼠左側(cè)腋下注射等量的ALR-tx或ALR-shRNA細(xì)胞,并在小鼠的右側(cè)腋下注射等量的Mock細(xì)胞作為對(duì)照。腹腔注射給予阿霉素治療(1.8 mg/kg/3q,即每3天給藥)。治療21天后,測(cè)量腫瘤的大小,并計(jì)算相對(duì)腫瘤體積及相對(duì)腫瘤增值率。并通過(guò)HE染色及透射電鏡技術(shù)觀察腫瘤的超微結(jié)構(gòu)。3.為研究ALR促進(jìn)HCC對(duì)阿霉素的敏感性是否與細(xì)胞凋亡相關(guān),本實(shí)驗(yàn)采用阿霉素(1.88μg/ml)處理細(xì)胞24 h及48 h后,檢測(cè)caspase活性,用western blot技術(shù)測(cè)定PARP剪切體的含量,并用流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況。4.為進(jìn)一步明確ALR表達(dá)與HCC耐藥的機(jī)制,實(shí)驗(yàn)繼續(xù)觀察阿霉素在細(xì)胞內(nèi)駐留情況。用不同劑量的阿霉素處理ALR-tx及ALR-shRNA的HepG2細(xì)胞及Bel-7402細(xì)胞2 h,用高內(nèi)涵技術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)藥物含量;并進(jìn)一步利用激光共聚焦顯微鏡觀察進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物含量。5.在確定ALR表達(dá)對(duì)HCC耐藥的影響與阿霉素細(xì)胞內(nèi)駐留有關(guān)之后,實(shí)驗(yàn)繼續(xù)研究多藥耐藥相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MDR-ABC)是否受到ALR的調(diào)節(jié)從而影響阿霉素細(xì)胞內(nèi)駐留,本實(shí)驗(yàn)采用qRT-PCR技術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)部分MDR-ABC家族分子(ABCB1,ABCC1,ABCC10及ABCG2)mRNA表達(dá)量,并用western blot技術(shù)測(cè)定了細(xì)胞中及腫瘤組織中ABCB1與ABCG2的蛋白表達(dá)量。6.實(shí)驗(yàn)中,采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù),在ALR-shRNA細(xì)胞中重新表達(dá)ALR,并檢測(cè)ABCB1和ABCG2的表達(dá),進(jìn)一步判定ALR基因表達(dá)參與調(diào)節(jié)ABCB1與ABCG2分子,從而阻止抗癌藥物在HCC細(xì)胞外排。并通過(guò)共聚焦顯微鏡和高含量分析儀測(cè)定阿霉素的細(xì)胞內(nèi)含量的變化。7.實(shí)驗(yàn)測(cè)定了當(dāng)細(xì)胞ALR含量變化時(shí),Snail及磷酸化AKT的變化情況,初步探索了ALR是否通過(guò)調(diào)節(jié)AKT/Snail/MDR-ABC途徑影響ABCB1及ABCG2的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.ALR-shRNA細(xì)胞的IC_(50)(2.90μg/ml)顯著高于Vector-tx(1.88μg/ml)細(xì)胞,而ALR-tx細(xì)胞IC_(50)值(1.25μg/ml)則明顯降低。在應(yīng)用1.88μg/ml阿霉素處理細(xì)胞48 h后更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d后,ALR-shRNA細(xì)胞的克隆形成率為ALR-tx細(xì)胞的4倍。其他HCC細(xì)胞系中也存在轉(zhuǎn)染ALR后,腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素敏感性增高的現(xiàn)象。2.在裸鼠荷瘤試驗(yàn)中,在經(jīng)阿霉素治療后,Mock組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率為54.12%,ALR-tx組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率達(dá)到82.37%,而ALR-shRNA組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率僅為9.94%。光鏡下觀察各組腫瘤組織切片,經(jīng)過(guò)阿霉素治療后,Mock組腫瘤組織切片隨處可見(jiàn)局灶性壞死,ALR-tx組壞死呈大片狀,與此相反,ALR-shRNA組壞死較輕。透射電鏡顯示,經(jīng)過(guò)阿霉素治療后,Mock組腫瘤組織細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)細(xì)胞核出現(xiàn)凋亡核型,ALR-tx組已基本不能分辨細(xì)胞結(jié)構(gòu),核膜破裂,核溶解的現(xiàn)象十分明顯,與此相反,ALR-shRNA組凋亡及壞死較少。3.Caspase 3活性測(cè)定顯示,經(jīng)1.88μg/ml阿霉素處理24 h后,ALR-tx細(xì)胞caspase 3活性明顯升高,約為處理前的2.3倍,其余各組細(xì)胞的caspase活性則未見(jiàn)明顯變化;經(jīng)過(guò)1.88μg/ml阿霉素處理48 h后,各組細(xì)胞caspase 3活性均出現(xiàn)明顯上升,其中ALR-tx細(xì)胞上升最為明顯,為處理前的3.3倍,ALR-shRNA細(xì)胞caspase 3活性為處理前的2.0倍,對(duì)照組細(xì)胞caspase 3活性為處理前的2.7倍。PARP剪切體含量測(cè)定顯示,經(jīng)1.88μg/ml阿霉素處理24 h后,ALR-tx細(xì)胞PARP剪切體含量上升最為明顯,為處理前的2.5倍;處理48 h后,ALR-shRNA細(xì)胞PARP剪切體含量最少,為處理前的3.5倍,同時(shí)ALR-tx細(xì)胞PARP剪切體含量則為處理前的4.5倍。流式細(xì)胞技術(shù)分析顯示,阿霉素處理24 h后,Mock組細(xì)胞和Vector-tx組細(xì)胞的凋亡率分別增加了20.3%和11.5%,同時(shí),ALR-tx組細(xì)胞的凋亡率增加了38.3%。阿霉素處理48 h后,Mock組細(xì)胞和Vector-tx細(xì)胞的凋亡率分別達(dá)到了32.7%和28.9%,ALR-tx組細(xì)胞的凋亡率則達(dá)到了39.4%。4.高內(nèi)涵技術(shù)定量分析細(xì)胞內(nèi)藥物含量顯示,在不同藥物劑量下,ALR-tx組細(xì)胞內(nèi)阿霉素含量與Vector-tx細(xì)胞內(nèi)熒相比明顯升高;而ALR-shRNA細(xì)胞內(nèi)藥物含量明顯低于Vector-tx細(xì)胞。而在經(jīng)過(guò)3μM維拉帕米預(yù)處理1 h后,各組細(xì)胞內(nèi)阿霉素含量均有一定程度的升高。5.ALR-shRNA細(xì)胞ABCB1的mRNA水平為ALR-tx細(xì)胞的3倍;ABCG2水平為ALR-tx細(xì)胞的4倍;而ALR-tx細(xì)胞與ALR-shRNA細(xì)胞的ABCC1及ABCC10水平無(wú)明顯差異。Western blot結(jié)果顯示,ALR-tx細(xì)胞ABCB1蛋白表達(dá)量為Vector-tx細(xì)胞的60%,ABCG2蛋白表達(dá)量為Vector-tx細(xì)胞的65%;ALR-shRNA細(xì)胞ABCG2蛋白表達(dá)量為Vector-tx細(xì)胞的2.3倍。6.挽救實(shí)驗(yàn)證實(shí),向ALR-shRNA細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ALR質(zhì)粒后,可以看到ALR的蛋白表達(dá)量有了明顯上升;同時(shí),ABCB1及ABCG2的蛋白表達(dá)量均較轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染空載體組有所下降,其中ABCB1下降了39.7%,ABCG2下降了33.6%。激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)阿霉素含量,可見(jiàn)當(dāng)ALR-shRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染ALR質(zhì)粒后,細(xì)胞內(nèi)阿霉素含量明顯升高,而轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞則沒(méi)有這種現(xiàn)象。高內(nèi)涵分析顯示當(dāng)ALR-shRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)ALR的質(zhì)粒后,細(xì)胞內(nèi)阿霉素含量約為轉(zhuǎn)染前的2倍。7.Western blot結(jié)果顯示,ALR-tx細(xì)胞Snail蛋白表達(dá)量為Mock細(xì)胞的80%,p-AKT T308位點(diǎn)磷酸化水平降低。ALR-shRNA細(xì)胞Snail蛋白表達(dá)量為Mock細(xì)胞的1.2倍,p-AKT T308位點(diǎn)及S473位點(diǎn)磷酸化水平升高。結(jié)論:于HCC中轉(zhuǎn)染ALR基因可以顯著抑制HCC細(xì)胞的耐藥性,其機(jī)制可能與ALR抑制AKT磷酸化及Snail活化,進(jìn)而減弱ABCB1和ABCG2轉(zhuǎn)錄與翻譯,從而增加諸如阿霉素等抗癌藥在癌細(xì)胞滯留有關(guān)。本研究結(jié)果提示,ALR基因有可能成為提高HCC化療療效的潛在靶分子,用于改善HCC治療及其預(yù)后。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 康凱夫;張艷麗;;ABCG2在原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌中的表達(dá)及臨床意義[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2011年16期

2 肖宇山;胡麗莉;;ABCG2基因單核苷酸多態(tài)性研究進(jìn)展[J];廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào);2010年05期

3 王飛通;周兵;劉小云;汪正偉;牛堅(jiān);魏鑫;劉斌;;吉西他濱誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞ABCG2表達(dá)其化療耐藥的關(guān)系研究[J];中國(guó)普通外科雜志;2014年03期

4 汝繼玲;何曉靜;邱楓;孫亞欣;肇麗梅;朱旭;;ABCB1基因多態(tài)性對(duì)卡馬西平血藥濃度的影響[J];中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志;2012年11期

5 徐衛(wèi)東,張春平,王桂榮;肝細(xì)胞癌的變化模式[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(內(nèi)科學(xué)分冊(cè));2000年10期

6 ;早期發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌可增加治療機(jī)會(huì)[J];河南醫(yī)學(xué)研究;2000年02期

7 Schafer DF,潘朝法,李蘇云;肝細(xì)胞癌[J];第四軍醫(yī)大學(xué)吉林軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2000年01期

8 中沼安二,林淑蘭,姚楨;有關(guān)小肝細(xì)胞癌病理學(xué)的最新認(rèn)識(shí)[J];日本醫(yī)學(xué)介紹;2000年05期

9 靜雨;;美國(guó)肝細(xì)胞癌發(fā)病率增高[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)情報(bào);2000年01期

10 張玉勛;;肝細(xì)胞癌的非手術(shù)治療[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)情報(bào);2000年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 邊芳;張明昌;;ABCG2在翼狀胬肉組織中的表達(dá)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十二屆全國(guó)眼科學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2007年

2 何暉;尹繼業(yè);徐雅靜;李曦;張瑜;徐瀟靜;鄭藝;陳娟;錢(qián)晨月;周宏灝;劉昭前;;ABCB1基因多態(tài)性與中危染色體核型急性髓細(xì)胞白血病治療結(jié)果的相關(guān)性研究[A];湖南省生理科學(xué)會(huì)2013年度學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2013年

3 邊芳;張明昌;;ABCG2抑制劑verapamil抑制翼狀胬肉成纖維細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十二屆全國(guó)眼科學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2007年

4 何暉;尹繼業(yè);徐雅靜;李曦;張瑜;李湘平;王瑛;周宏灝;劉昭前;;ABCB1基因多態(tài)性與昂丹司瓊治療化療引起惡心、嘔吐的療效的相關(guān)性[A];湖南省生理科學(xué)會(huì)2013年度學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2013年

5 汝繼玲;何曉靜;孫亞欣;邱楓;肇麗梅;;ABCB1基因多態(tài)性與卡馬西平血藥濃度相關(guān)性研究[A];中國(guó)藥理學(xué)會(huì)第十一次全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議�？痆C];2011年

6 卞讀軍;;肝細(xì)胞癌經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞前后磁共振波譜研究[A];2009中華醫(yī)學(xué)會(huì)影像技術(shù)分會(huì)第十七次全國(guó)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2009年

7 賈建偉;趙潔;;肝細(xì)胞癌領(lǐng)域研究現(xiàn)狀與進(jìn)展[A];中醫(yī)藥防治感染病之研究（九）——第九次全國(guó)中醫(yī)藥防治感染病學(xué)術(shù)交流大會(huì)論文集[C];2009年

8 陳孝平;;肝細(xì)胞癌外科治療進(jìn)展[A];湖北省第21屆腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2011年

9 張杰;劉軍建;韓云;張寧;芮靜安;金城;周柔麗;;用熒光差異顯示法篩選肝細(xì)胞癌相關(guān)新基因[A];2000全國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2000年

10 馮仕庭;李子平;譚國(guó)勝;孫燦輝;彭振鵬;;中晚期肝細(xì)胞癌的多層螺旋CT血管造影表現(xiàn)及臨床應(yīng)用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十三屆全國(guó)放射學(xué)大會(huì)論文匯編（下冊(cè)）[C];2006年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前3條

1 中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)臨床腫瘤學(xué)協(xié)作專業(yè)委員會(huì)主任委員 秦叔逵;治療肝細(xì)胞癌 別只盯著靶向藥[N];健康報(bào);2013年

2 記者 王丹 管九蘋(píng);肝細(xì)胞癌標(biāo)志物研究獲新進(jìn)展[N];健康報(bào);2013年

3 吳一福;四軍醫(yī)大唐都醫(yī)院發(fā)現(xiàn)硒蛋白P與肝細(xì)胞癌發(fā)生有關(guān)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 郭圓圓;肝再生增強(qiáng)因子通過(guò)降低ABCB1和ABCG2的表達(dá)增強(qiáng)肝細(xì)胞癌對(duì)阿霉素的敏感性[D];首都醫(yī)科大學(xué);2017年

2 李靜;復(fù)方土茯苓顆粒治療痛風(fēng)患者高尿酸血癥療效及基于ABCG2降尿酸機(jī)制研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2016年

3 趙菊平;ABCG2與腎癌藥物抵抗性關(guān)系的研究[D];上海交通大學(xué);2015年

4 白蘭;乙肝病毒捕獲細(xì)胞因子和信號(hào)級(jí)聯(lián)以逃避宿主免疫并維持持續(xù)感染[D];武漢大學(xué);2014年

5 何洪衛(wèi);肝細(xì)胞癌內(nèi)γδT細(xì)胞浸潤(rùn)減少及功能缺陷的機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

6 蔡曉燕;淋巴細(xì)胞在肝細(xì)胞癌和癌旁組織中的差異性表達(dá)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

7 向?qū)?細(xì)胞周期因子FoxM1促進(jìn)肝臟再殖的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

8 康富標(biāo);共刺激分子B7-H3在肝細(xì)胞癌的表達(dá)及相關(guān)機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

9 楊純;Gankyrin正反饋調(diào)控Nrf2在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮抗氧化作用[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

10 高霞;PNPLA3基因單核苷酸多態(tài)性及基因表達(dá)與乙肝病毒感染易感性及乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌的關(guān)聯(lián)性研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 鐘進(jìn)彥;中國(guó)漢族人群ABCB1基因啟動(dòng)子甲基化與氯吡格雷藥效動(dòng)力學(xué)的關(guān)聯(lián)研究[D];寧波大學(xué);2015年

2 王飛;CDH17調(diào)控肝細(xì)胞癌的生物學(xué)機(jī)制的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

3 陳中博;咖啡攝入與肝細(xì)胞癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的Meta分析[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 張華鵬;核受體輔激活蛋白5在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[D];鄭州大學(xué);2015年

5 郭慧敏;血清sCD25測(cè)定在肝細(xì)胞癌診斷中的意義[D];鄭州大學(xué);2015年

6 凌青霞;雙氧化酶1（Duox1）在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)調(diào)控及作用研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

7 李會(huì)芬;血清Talin-1在肝細(xì)胞癌診斷中的作用[D];鄭州大學(xué);2015年

8 蒙錦瑩;血管生長(zhǎng)相關(guān)因子的血清濃度與肝細(xì)胞癌預(yù)后的相關(guān)性研究[D];蘭州大學(xué);2015年

9 戰(zhàn)勇;肝細(xì)胞癌術(shù)前造影參數(shù)與生物學(xué)表現(xiàn)相關(guān)性及術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)因素討論[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

10 姚樂(lè);microRNA-32在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床預(yù)后意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：1543430