本文關(guān)鍵詞： 胃癌 轉(zhuǎn)移 miR-214 CREB1 CSF1　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：胃癌是我國及世界上最常見的惡性腫瘤之一,胃癌患者的預(yù)后較差。浸潤轉(zhuǎn)移是胃癌的一個重要特征,常導(dǎo)致患者預(yù)后不良。揭示胃癌浸潤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制是胃癌基礎(chǔ)和臨床研究的重要課題。除了基因?qū)W的改變以外,非編碼RNA特別是microRNA(miRNA,miR),對腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。miRNA是一類內(nèi)生性的、長度約19-25個核苷酸的小RNA,主要是通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)結(jié)合,降解靶mRNA或抑制靶蛋白的翻譯,廣泛參與增殖、凋亡、發(fā)育、分化等多種生物學(xué)過程,在人類疾病包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。而目前尚未見miR-214在胃癌中的詳細(xì)研究。本研究擬在人胃癌組織及細(xì)胞系中檢測miR-214的表達(dá)情況,進(jìn)行miR-214功能學(xué)實(shí)驗(yàn)以探究其生物學(xué)作用,并鑒定其調(diào)控的靶基因。預(yù)測軟件提示cAMP responsive element binding protein 1(CREB1,cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白)可能是miR-214的一個靶基因,本課題擬初步探究CREB1在胃癌中的表達(dá)、功能及分子機(jī)制,以期為胃癌的診斷和治療提供新的方法和靶點(diǎn)。第一部分胃癌中miR-214表達(dá)的臨床意義及其對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響研究目的:1.檢測miR-214在胃癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況。2.分析miR-214與臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后的關(guān)系。3.探究miR-214對胃癌細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移及增殖、凋亡的影響。4.鑒定miR-214直接調(diào)控的靶基因。研究方法:1.使用實(shí)時定量PCR檢測80例胃癌組織和18例非腫瘤胃黏膜組織及4種胃癌細(xì)胞株(MKN28、BGC823、MKN45及SGC7901)、1種非腫瘤的永生化細(xì)胞株GES-1中miR-214的表達(dá)情況。2.收集患者臨床資料及隨訪信息,分析miR-214與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)的關(guān)系。Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗(yàn)分析miR-214的預(yù)后價值。3.胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染LV3-hsa-miR-214(過表達(dá))、miR-214 inhibitor(抑制劑)及Negativecontrol(陰性對照)后,進(jìn)行細(xì)胞遷移浸潤和增殖、凋亡實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證其生物學(xué)功能。4.使用TargetScan軟件預(yù)測miR-214的靶基因,通過熒光素酶檢測和Western blot實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證miR-214調(diào)控的直接靶基因。結(jié)果:1.80例胃癌組織中miR-214的表達(dá)水平較18例非腫瘤胃黏膜組織下調(diào)約6倍,在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中下調(diào)更明顯。同時,4種胃癌細(xì)胞中miR-214的表達(dá)水平較非腫瘤胃粘膜組織也呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)。2.miR-214的表達(dá)與腫瘤直徑及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。然而生存分析顯示miR-214對患者的預(yù)后無明顯影響。3.miR-214可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移浸潤能力,而對細(xì)胞凋亡無明顯作用。4.靶基因軟件 TargetScan 預(yù)測提示 FGFR1、CSF1、NOTCH2、CREB1、AGAP2等是miR-214的潛在靶基因。熒光素酶實(shí)驗(yàn)和Western blot證實(shí)CSF1是miR-214的直接靶基因。結(jié)論及意義:miR-214在胃癌組織和多種胃癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào),在轉(zhuǎn)移性的胃癌組織中降低更明顯。miR-214可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移浸潤能力,而對細(xì)胞凋亡無明顯影響。CSF1是miR-214的直接靶基因。miR-214對其它靶基因(如CREB1等)的調(diào)控作用有待進(jìn)一步驗(yàn)證。miR-214可下調(diào)CSF1的表達(dá),miR-214可能通過調(diào)控CSF1發(fā)揮了抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移浸潤的作用。第二部分胃癌中CREB1的表達(dá)、預(yù)后價值及miRNA對其的調(diào)控作用研究目的:1.檢測CREB1在胃癌組織中的表達(dá)情況。2.分析CREB1在胃癌中的臨床意義及預(yù)后價值。3.驗(yàn)證CREB1是否受到miR-214等miRNA的調(diào)節(jié)。研究方法:1.免疫組化檢測185例原發(fā)灶胃癌組織、50例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶胃癌組織、50例非腫瘤胃粘膜組織中CREB1蛋白的表達(dá)情況。2.使用卡方檢驗(yàn)分析CREB1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗(yàn)分析CREB1表達(dá)與病人預(yù)后的關(guān)系。3.使用miRWalk、starBase軟件預(yù)測可能調(diào)控CREB1的miRNA,通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)、Western blot驗(yàn)證miRNA對CREB1的調(diào)控作用。結(jié)果:1.CREB1在非腫瘤胃粘膜組織、胃癌原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中呈遞增式表達(dá)。CREB1表達(dá)水平在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織相比于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中明顯升高。2.CREB1的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分期正相關(guān)。3.CREB1高表達(dá)的患者的總生存時間和無瘤生存時間明顯短于CREB1低表達(dá)的患者。CREB1與腫瘤分期聯(lián)合構(gòu)建的模型,是一個獨(dú)立的預(yù)后因子。4.CREB1 是 miR-27b 和 miR-200b 的直接靶基因,受到 miR-27b 和 miR-200b 的負(fù)向調(diào)控。結(jié)論及意義:CREB1的高表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和患者預(yù)后不良相關(guān)。miR-27b和miR-200b可負(fù)向調(diào)節(jié)CREB1的表達(dá)。CREB1是一個有價值的生物標(biāo)記物,對胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病人預(yù)后有重要提示作用。miR-27b/200b-CREB1信號通路可能為胃癌的治療提供新的靶點(diǎn)。第三部分CREB1在胃癌中的功能及作用機(jī)制初探研究目的:1.探究CREB1在胃癌中的生物學(xué)功能。2.鑒定轉(zhuǎn)錄因子CREB1的下游靶基因,初步探討CREB1的作用機(jī)制。研究方法:1.在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)CREB1或干擾CREB1的表達(dá),檢測其對細(xì)胞增殖、遷移浸潤能力的影響。2.在胃癌細(xì)胞中,利用染色質(zhì)免疫共沉淀測序(Chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)分析轉(zhuǎn)錄因子CREB1在全基因組的結(jié)合譜,篩選CREB1可能調(diào)控的 mRNA、miRNA、lncRNA。3.在細(xì)胞轉(zhuǎn)染CREB1過表達(dá)質(zhì)�；駽REB1干擾RNA之后,使用實(shí)時定量PCR檢測CREB1下游候選lncRNA的表達(dá)水平。4.使用ChIP-qPCR(染色質(zhì)免疫共沉淀-實(shí)時定量PCR)證實(shí)CREB1與lncRNA啟動子的結(jié)合。結(jié)果:1.過表達(dá)CREB1能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移浸潤;反之,下調(diào)CREB1表達(dá)則抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移浸潤。2.ChIP-seq結(jié)果提示CREB1 可以結(jié)合到831 個mRNA、276個IncRNA、62個miRNA的啟動子區(qū)。3.ChIP-seq的結(jié)果與本課題組前期做的胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)IncRNA芯片取交集,將候選IncRNA范圍縮減為9個。4.通過實(shí)時定量PCR驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)CREB1可正向調(diào)節(jié)lncRNALOC100270746、PIN1P1 及 ZEB1-AS1 的表達(dá)。5.ChIP-qPCR結(jié)果顯示CREB1在lncRNA的啟動子區(qū)有顯著富集。結(jié)論及意義:CREB1能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移浸潤。LncRNA LOC100270746、PIN1P1及ZEB1-AS1的表達(dá)受到CREB1的正向調(diào)控。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

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