本文關(guān)鍵詞： 鯊烯環(huán)氧化酶 肝細(xì)胞癌 細(xì)胞生長 細(xì)胞遷移 ERK信號　出處：《東南大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：原發(fā)性肝癌居腫瘤相關(guān)死因的第三位,其中90%以上的病例為肝細(xì)胞癌。多項(xiàng)研究表明膽固醇代謝在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,使用他汀抑制腫瘤細(xì)胞中膽固醇的合成對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有顯著抑制作用。由于他汀的靶點(diǎn)]HMGCR位于膽固醇合成上游位置,其在抑制膽固醇合成的同時(shí),對其他終產(chǎn)物也存在抑制作用。因此,他汀的副作用亦不可忽視,從膽固醇合成通路的下游尋找新的治療靶點(diǎn)尤為重要。鯊烯環(huán)氧化酶(SQLE)位于膽固醇合成的下游。已有研究表明SQLE在乳腺癌、胰腺癌、直結(jié)腸癌等腫瘤中的表達(dá)發(fā)生異常。但是SQLE在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)模式、相關(guān)功能及分子機(jī)制不明。為了揭示SQLE在肝癌組織中的表達(dá)模式,借助于熒光定量PCR、免疫組化和Western Blot技術(shù),我們檢測了肝癌組織及配對的正常組織中SQLE的mRNA水平和蛋白水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與配對的正常組織相比,SQLE在肝癌組織中的表達(dá)水平呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。SQLE在肝細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的惡性程度有一定相關(guān)性。這提示SQLE的表達(dá)很可能參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展。上調(diào)SQLE的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長、遷移及其在軟瓊脂上的克隆形成能力。在肝癌細(xì)胞中下調(diào)SQLE的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞生長、遷移及其在軟瓊脂上的克隆形成能力。而且,沉默SQLE在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力。進(jìn)一步的機(jī)制研究顯示,SQLE過表達(dá)激活Ras-ERK信號,上調(diào)ERK的磷酸化水平。綜上所述,SQLE通過激活Ras-ERK信號從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的惡性行為。我們的研究可以分為如下兩個(gè)部分。第一章SQLE在肝癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)研究目的：研究肝癌組織及配對的正常組織、正常肝細(xì)胞及肝癌細(xì)胞株中SQLE的蛋白水平和mRNA水平,確定SQLE在肝癌中的表達(dá)模式。研究方法：利用熒光定量PCR檢測SQLE在40例肝癌組織及配對的正常組織中的表達(dá)；隨機(jī)挑取6例肝癌組織及配對的正常組織,利用Western Blot檢測SQLE的蛋白水平,對熒光定量PCR的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,從中挑取1例肝癌組織及配對的正常組織,利用免疫組化染色檢測SQLE的蛋白水平,進(jìn)一步確定熒光定量PCR的結(jié)果；利用Western Blot檢測SQLE在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)。研究結(jié)果：與配對的正常組織相比,SQLE的mRNA水平在肝癌組織中上調(diào)；免疫組化染色和Western Blot結(jié)果顯示,SQLE蛋白水平在肝癌組織中升高,進(jìn)一步驗(yàn)證了熒光定量PCR的結(jié)果；SQLE的表達(dá)與細(xì)胞株的惡性程度相關(guān),在正常肝細(xì)胞株中SQLE的表達(dá)水平較低,在肝癌細(xì)胞株中SQLE的表達(dá)水平較高。結(jié)論：SQLE在肝癌組織和肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平上調(diào)。這提示SQLE很可能在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。第二章SQLE對肝癌細(xì)胞惡性行為及ERK信號的影響研究目的：研究SQLE的表達(dá)對肝癌細(xì)胞生長、遷移、非錨定性克隆集落和體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響,揭示SQLE在肝癌中的功能。研究方法：構(gòu)建SQLE表達(dá)載體,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在肝癌細(xì)胞HepG2、 7404中過表達(dá)SQLE;以結(jié)晶紫法檢測SQLE表達(dá)上調(diào)對肝癌細(xì)胞生長的影響;以軟瓊脂集落法研究過表達(dá)SQLE對肝癌細(xì)胞非錨定性生長能力的影響；以Boyden Chamber細(xì)胞遷移模型檢測過表達(dá)SQLE對肝癌細(xì)胞體外遷移能力的影響。同時(shí),構(gòu)建RNA干擾的病毒載體,在肝癌細(xì)胞HepG2、 MHCC97中沉默SQLE的表達(dá)；以結(jié)晶紫法檢測SQLE表達(dá)下調(diào)對肝癌細(xì)胞生長的影響；以軟瓊脂集落法檢測SQLE下調(diào)后肝癌細(xì)胞克隆形成的變化；以Boyden Chamber細(xì)胞遷移模型檢測下調(diào)SQLE的表達(dá)對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響；利用心臟注射,結(jié)合小動(dòng)物體內(nèi)成像平臺(tái),檢測SQLE表達(dá)下調(diào)對肝癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。在上述實(shí)驗(yàn)的同時(shí),檢測SQLE的表達(dá)對ERK磷酸化水平的影響。研究結(jié)果：通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和G418抗性篩選,在肝癌細(xì)胞HepG2和7404中建立了過表達(dá)SQLE的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。通過結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)、Boyden Chamber實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SQLE促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2和7404的生長、遷移和在軟瓊脂上的非錨定性生長的能力。同時(shí),通過成功構(gòu)建了SQLE RNA干擾的慢病毒載體,在肝癌細(xì)胞HepG2、 MHCC97中干擾SQLE的表達(dá)。通過結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)、Boyden Chamber實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)SQLE的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞HepG2和MHCC97的生長、遷移和在軟瓊脂上的非錨定性生長的能力。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,干擾SQLE在HepG2中的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的遷移能力。另一方面,SQLE在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著上調(diào)ERK的磷酸化水平,干擾SQLE的表達(dá)抑制ERK的磷酸化。并且,干擾ERK的表達(dá)解除了SQLE對肝癌細(xì)胞生長的促進(jìn)作用。結(jié)論：SQLE在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長、遷移、克隆形成和體內(nèi)轉(zhuǎn)移,SQLE通過活化ERK信號通路對肝癌的發(fā)生發(fā)展起重要的促進(jìn)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

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本文編號：1509500