本文關(guān)鍵詞： 食管鱗狀細(xì)胞癌 腫瘤相關(guān)抗原 自身抗體 早期診斷 logistic回歸模型　出處：《鄭州大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的使用血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)(serological proteome analysis,SERPA)篩選、檢索基因組學(xué)與食管鱗癌診斷相關(guān)文獻(xiàn)、系統(tǒng)綜述抗腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigens,TAAs)自身抗體與食管癌診斷相關(guān)研究,回顧總結(jié)本課題組前期研究結(jié)果,鑒定可能的特異性候選食管鱗狀細(xì)胞癌(食管鱗癌,esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)相關(guān)抗原,設(shè)計(jì)并優(yōu)化出可以用于ESCC診斷的抗-TAAs自身抗體組合,構(gòu)建相應(yīng)的ESCC患病預(yù)測(cè)模型,對(duì)所優(yōu)化組合用于ESCC早期診斷的可能性和可行性進(jìn)行全面的評(píng)價(jià),并使用一組獨(dú)立的人群樣本資料對(duì)所構(gòu)建的患病預(yù)測(cè)模型的診斷價(jià)值進(jìn)行驗(yàn)證,為建立一種新的食管鱗癌早期體外非侵入性診斷技術(shù)提供依據(jù)和資料。方法1.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選和鑒定可能的候選ESCC相關(guān)抗原。1)Western blot方法初步篩選候選ESCC相關(guān)抗原及對(duì)應(yīng)抗體陽(yáng)性的患者血清:使用102例ESCC患者血清和58例正常對(duì)照血清與食管鱗癌細(xì)胞系TE-2、TE-8、EC1和EC9706全蛋白進(jìn)行Western blot雜交,篩選ESCC患者血清中對(duì)應(yīng)自身抗體陽(yáng)性率≥10%,并且對(duì)應(yīng)自身抗體在ESCC患者血清中陽(yáng)性率大于正常對(duì)照血清中陽(yáng)性率(p0.05)的反應(yīng)條帶所對(duì)應(yīng)的蛋白作為可能的候選ESCC相關(guān)抗原,同時(shí)挑選出針對(duì)候選ESCC相關(guān)抗原特異性陽(yáng)性反應(yīng)的ESCC患者血清。2)使用免疫熒光方法進(jìn)一步驗(yàn)證Western blot篩選出來(lái)的針對(duì)候選ESCC相關(guān)抗原呈陽(yáng)性反應(yīng)的患者血清,并觀察候選腫瘤相關(guān)抗原的細(xì)胞學(xué)定位。3)使用SERPA技術(shù)篩選和鑒定候選食管鱗癌相關(guān)抗原:裂解TE-8細(xì)胞株全蛋白,在相同條件下同時(shí)進(jìn)行三根IPG預(yù)制膠條的等電聚焦電泳,SDS-PAGE凝膠電泳后,其中一塊凝膠使用考馬斯亮藍(lán)R250染色,另外兩塊凝膠電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane,NC膜)后分別與上述挑選出的陽(yáng)性ESCC患者血清和正常對(duì)照血清進(jìn)行Western blot雜交,雜交后的結(jié)果與考馬斯亮藍(lán)R250染色凝膠進(jìn)行比對(duì),將血清學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析和鑒定,確定所篩選出候選ESCC相關(guān)抗原的種類和詳細(xì)信息。2.候選TAAs的原核表達(dá)和純化:在基于SERPA方法篩選候選TAAs的基礎(chǔ)上,檢索基因組學(xué)與食管鱗癌相關(guān)文獻(xiàn),系統(tǒng)綜述抗-TAAs自身抗體與食管癌診斷相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,結(jié)合本課題組前期相關(guān)研究結(jié)果,對(duì)可能的食管鱗癌候選TAAs進(jìn)行原核表達(dá)和純化。1)候選TAAs原核表達(dá)載體的構(gòu)建:提取EC9706細(xì)胞株總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用特異性PCR引物擴(kuò)增出目的基因,連接入克隆載體后進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析,鑒定正確的目的基因連接入原核表達(dá)載體pET-28a中。2)候選TAAs的原核表達(dá)和純化:將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主表達(dá)菌中,優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)濃度,對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行可溶性分析�？扇苄员磉_(dá)蛋白使用不同濃度的咪唑進(jìn)行純化,不可溶性表達(dá)蛋白使用不同pH值的8M尿素進(jìn)行純化,并對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定。3)純化蛋白的免疫學(xué)活性鑒定:使用特異性抗體與所純化蛋白進(jìn)行Western blot雜交,鑒定所純化蛋白是否具有免疫學(xué)活性。3.候選TAAs自身抗體在ESCC診斷中的價(jià)值評(píng)價(jià)以及ESCC患病預(yù)測(cè)模型的建立與驗(yàn)證。1)單個(gè)抗-TAA自身抗體指標(biāo)對(duì)食管鱗癌的診斷價(jià)值評(píng)價(jià):采取間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法檢測(cè)每種抗-TAA自身抗體在不同研究對(duì)象血清中的相對(duì)表達(dá)量,使用秩和檢驗(yàn)或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較每種抗-TAA自身抗體在ESCC患者組和正常對(duì)照組血清中的表達(dá)量差異;以受試組(包括324例ESCC患者和324例正常對(duì)照)中每個(gè)研究對(duì)象血清中每種抗-TAA自身抗體的表達(dá)含量為自變量,ESCC患病事件作為因變量,采取logistic回歸的方法得出每種抗-TAA自身抗體的表達(dá)與ESCC患病事件的回歸方程并計(jì)算出各個(gè)研究對(duì)象患食管鱗癌的預(yù)測(cè)概率,以預(yù)測(cè)概率=0.5作為截?cái)嘀?判定每種自身抗體用于診斷ESCC的靈敏度和特異度,受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC曲線)分析評(píng)價(jià)每種自身抗體對(duì)ESCC的診斷價(jià)值。將ESCC患者分為早期ESCC組(TNM分期為0,I和II期)和晚期ESCC組(TNM分期為III和IV期),統(tǒng)計(jì)并比較各自身抗體指標(biāo)對(duì)不同分期ESCC患者診斷的陽(yáng)性率,以判定是否具有特異性的早期ESCC相關(guān)抗原指標(biāo)。2)建立ESCC患病預(yù)測(cè)模型:以受試組人群為研究對(duì)象,根據(jù)每個(gè)研究對(duì)象血清中檢測(cè)自身抗體的含量與ESCC患病事件,采用后退(條件)逐步logistic回歸法篩選自變量并構(gòu)建相應(yīng)的預(yù)測(cè)模型,計(jì)算出各個(gè)研究對(duì)象患食管鱗癌的預(yù)測(cè)概率,以預(yù)測(cè)概率=0.5作為截?cái)嘀?判定患病預(yù)測(cè)模型用于診斷ESCC的靈敏度和特異度,并使用ROC曲線分析評(píng)價(jià)該模型對(duì)受試組中ESCC患者的診斷價(jià)值。逐一剔除納入自變量后對(duì)預(yù)測(cè)模型診斷價(jià)值(包括靈敏度、特異度、AUC以及判定結(jié)果符合率等)貢獻(xiàn)最小的抗-TAA自身抗體指標(biāo),構(gòu)建新的預(yù)測(cè)模型,并判定所構(gòu)建預(yù)測(cè)模型對(duì)ESCC的診斷價(jià)值,以優(yōu)化抗-TAAs自身抗體組合。3)預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證:以驗(yàn)證組人群(包括186例ESCC患者和186例正常對(duì)照)為研究對(duì)象,將各個(gè)研究對(duì)象對(duì)應(yīng)TAAs自身抗體含量代入上述構(gòu)建預(yù)測(cè)模型中,根據(jù)預(yù)測(cè)概率確定食管鱗癌患病事件,使用ROC曲線分析評(píng)價(jià)構(gòu)建模型在驗(yàn)證組中對(duì)ESCC的診斷價(jià)值。4)所構(gòu)建預(yù)測(cè)模型對(duì)不同分期ESCC患者的診斷:分別評(píng)價(jià)并比較上述構(gòu)建預(yù)測(cè)模型對(duì)受試組和驗(yàn)證組早期ESCC患者和晚期ESCC患者的診斷價(jià)值,以分析預(yù)測(cè)模型是否具有早期ESCC診斷特異性。使用預(yù)測(cè)模型對(duì)研究對(duì)象中所有早期ESCC患者與正常對(duì)照進(jìn)行判定,以預(yù)測(cè)模型從正常人群中區(qū)分出早期ESCC患者的能力,從而進(jìn)一步評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)模型對(duì)于早期ESCC的診斷價(jià)值。結(jié)果1.使用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選和鑒定出四種候選的食管鱗癌相關(guān)抗原Western blot方法篩選發(fā)現(xiàn)分子量在40kD、50kD以及65kD附近的三條蛋白條帶的自身抗體在ESCC患者血清中陽(yáng)性率明顯高于正常對(duì)照血清;質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示SERPA方法篩選出的候選TAAs分別為hnRNP1A2B1 isform A2(異質(zhì)核核糖核蛋白A2/B1的A2亞型,36kD)、CALR(鈣網(wǎng)蛋白,48kD)、ENO1(烯醇酶-1,47kD)和HSPD1(熱休克蛋白60,61kD)。2.成功構(gòu)建了hnRNPA2B1、CALR、HSPD1和NICD(NOTCH1胞內(nèi)段)四種重組蛋白的原核表達(dá)載體,并成功表達(dá)和純化出這四種候選TAAs重組蛋白,且所純化出的蛋白均具有免疫學(xué)活性。3.對(duì)研究對(duì)象中15種TAAs(hnRNPA2B1、CALR、ENO1、HSPD1、p53、NICD、c-myc、p62/IMP2、MDM2、p90/CIP2A、p16/INK4A、HCCR/LETMD1、IMP1、Koc/IMP3和Cyclin E)自身抗體水平進(jìn)行分析,成功建立起一種基于10種TAAs(p53、p62、HCCR、c-myc、MDM2、hnRNPA2B1、NICD、ENO1、Koc和IMP1)的食管鱗癌患病logistic回歸預(yù)測(cè)模型,該預(yù)測(cè)模型應(yīng)用于受試組研究對(duì)象ESCC診斷的靈敏度為71.6%,特異度為85.2%,AUC為0.871(95%CI:0.843-0.896),判定結(jié)果符合率為78.4%。對(duì)抗-TAAs自身抗體組合進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化,基于9種抗-TAAs抗體組合(p53、p62、HCCR、c-myc、MDM2、hnRNPA2B1、NICD、ENO1和Koc)的預(yù)測(cè)模型用于ESCC診斷所對(duì)應(yīng)的AUC最大(AUC=0.872,95%CI:0.844-0.897),而基于7種自身抗體(p53、p62、HCCR、c-myc、MDM2、hnRNPA2B1和NICD)的預(yù)測(cè)模型對(duì)研究對(duì)象是否患病的判定結(jié)果符合率最高(判定結(jié)果符合率為79.2%)。該7種自身抗體預(yù)測(cè)模型對(duì)于受試組食管鱗癌診斷的AUC為0.864,靈敏度為71.9%,特異度為86.4%,對(duì)于驗(yàn)證組食管鱗癌診斷的AUC為0.862,靈敏度為65.6%,特異度為90.3%。與其它組合相比,該7種自身抗體組合具有較高的診斷效能和更高的性價(jià)比,并且該模型能夠較好的從正常人群中區(qū)分出早期ESCC患者,對(duì)早期ESCC患者診斷的AUC為0.864,靈敏度為71.9%,特異度為87.8%,總判定結(jié)果符合率為83.7%。結(jié)論1.hnRNP1A2B1、CALR、ENO1和HSPD1可能是候選的食管鱗癌相關(guān)抗原。2.基于7種抗-TAAs自身抗體組合(p53、p62、HCCR、c-myc、MDM2、hnRNPA2B1和NICD)的預(yù)測(cè)模型能夠?qū)κ彻荀[癌,尤其是早期食管鱗癌提供一定的診斷價(jià)值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.1

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本文編號(hào)：1506725