本文關鍵詞： 消化道腫瘤 肝癌 乙肝病毒X蛋白 NK細胞 PD-1　出處：《山東大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：消化道腫瘤是指起源于消化道及其附屬器官的腫瘤,包括食管癌、胃癌、肝癌等。多種消化道腫瘤的發(fā)生發(fā)展都與病原體感染及其所引起的慢性炎癥相關,例如,乙肝相關性肝癌,幽門螺旋桿菌感染相關性胃癌等。所以針對消化道腫瘤發(fā)病機制的研究一方面致力于研究病原體對促進消化道腫瘤發(fā)生發(fā)展的直接作用,希望揭示病原體的致癌機制并進行干預;另一方面,病原體感染引起炎癥,炎癥與腫瘤的關系日益引起研究者的重視。慢性炎癥是導致腫瘤發(fā)生和進展確切的因素之一。和不同類型消化道腫瘤發(fā)病相關的病原體不同,但它們的共同特點是可以持續(xù)介導炎癥。大量免疫細胞被募集到病灶中,在各種因素的共同作用下經歷免疫失能,失去其抗病原體抗腫瘤的作用,甚至可促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。因此,研究者在關注病原體直接致癌的同時,從未忽視病原體引起的慢性炎癥改變對腫瘤的作用。乙肝病毒感染是現已發(fā)現的最為明確導致肝癌的高危因素之一,我們選擇了乙肝病毒相關性肝癌為代表,希望揭示病原體對誘導機體正常組織癌變的可能機制。大量已發(fā)表的研究證實,乙肝病毒的多種病毒成分在體外可促進肝癌細胞系的增殖和遷移,提示乙肝病毒自身的病毒蛋白和復制過程直接促進肝癌的發(fā)生發(fā)展,但是機制不甚明了。這是本研究第一部分主要關注的內容。本研究第二部分著重關注包括肝癌在內的多種消化道腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,炎癥微環(huán)境在其中發(fā)揮的作用。在慢性炎癥發(fā)展過程中,多種免疫細胞被募集至區(qū)域微環(huán)境中,逐步被馴化,并最終有利于腫瘤的發(fā)生。腫瘤馴化導致的免疫細胞失能已經被認為是導致腫瘤進展最重要的機制之一。因此本研究從病原體自身和炎癥微環(huán)境兩方面入手,揭示包括肝癌在內的多種消化道腫瘤的發(fā)病機制,希望找到合適的藥物靶點,研發(fā)新藥物,促進消化道腫瘤的治療。第一部分:乙肝病毒X蛋白通過下調磷酶PPM1a過度激活TGF-β信號通路促進肝癌的發(fā)生發(fā)展乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)簡稱乙肝病毒,屬嗜肝DNA病毒,肝細胞表面有其受體,因此其感染人體后主要的靶器官是肝臟,在肝細胞中繁殖、復制、利用肝細胞中的細胞器表達病毒蛋白,破壞肝細胞,引起肝臟炎癥。病毒基因組可全部或部分整合入肝細胞染色體中,或是合成cccDNA與細胞內組蛋白結合后形成病毒的微小染色體,不易被清除�，F在已經明確,HBV感染是肝癌的最重要危險因素之一,在中國,90%以上的肝癌患者都有HBV感染背景。中國是乙肝大國,據統(tǒng)計,現階段中國攜帶乙肝病毒的人數可達2億,相當于每7個人中就有1位是乙肝病毒攜帶者。這些數據強烈提示了關注乙肝病毒及其致癌機制是中國科學家們不可推卸又任重道遠的責任。本課題組長期致力于研究HBV及其病毒蛋白致肝癌的機制。大量研究已經證實,乙肝病毒X蛋白(Hepatitis BX protein,HBx)在促進病毒復制以及誘導肝細胞癌變方面發(fā)揮了重要作用,是一個臭名昭著的癌蛋白。但是其促進肝癌發(fā)生發(fā)展的機制仍然不清楚,未找到很好的藥物靶點來干預這一過程。在本研究中,我們發(fā)現HBx可以通過促進磷酸酶PPM1a的泛素化降解下調PPM1a,使磷酸化相關信號通路TGF-β信號通路中的活化的信使分子pSmad2/3不能被及時的去磷酸化失活,導致TGF-β信號通路過度激活,該信號通路能明顯促進肝癌的遷移與侵襲。以下是我們的研究成果。(1)TGF-β信號通路被激活時,HBx可以明顯降低細胞內PPM1a的蛋白水平:我們在兩種肝癌細胞系HepG2及Bel-7402中分別轉染HBx的表達質粒pcDNA3-HBx-HA及其對照質粒pcDNA3,然后給予細胞TGF-β細胞因子刺激激活TGF-β信號通路,Western Blot檢測蛋白水平。結果顯示HBx明顯降低細胞內PPM1a的蛋白含量,過度激活TGF-β信號通路。并且,HBx對PPM1a的抑制作用具有時間和劑量依賴性。(2)HBx和TGF-β在促進肝癌細胞轉移上有協(xié)同作用:我們向HepG2和Bel-7402細胞內轉染pcDNA-HBx-HA或者pcDNA3,12h后給予細胞持續(xù)TGF-β刺激或不刺激。Tranwell小室實驗檢測4組細胞的遷移能力。結果表明,轉染了 HBx不加TGF-β刺激和轉染了空載體但是加入TGF-β刺激的細胞遷移能力均強于轉染.了空載體不加刺激的細胞,證實HBx和TGF-β可以促進細胞遷移,但是轉染了HBx同時加入TGF-β刺激的細胞遷移能力明顯強于單一轉染HBx的細胞或者是單一加入TGF-β刺激的細胞,提示HBx和TGF-信號通路在促進肝癌細胞遷移上具有明顯協(xié)同作用。兩種細胞系中的結果一致。(3)PPM1a質粒拯救實驗可以削弱HBx對肝癌細胞的促遷移能力:下一步我們外源轉入PPM1a的表達質粒pcDNA3-PPM1a-Flag抵消HBx對PPMla的抑制,Transwell小室遷移與侵襲實驗檢測細胞運動能力的變化。結果表明:和單純轉染2ug的pcDNA3空載體的對照組細胞相比,轉染lug HBx表達質粒和lug pcDNA3的細胞遷移侵襲能力增強,但是轉染lug HBx表達質粒的同時轉染lug PPM1a的表達質粒,可以觀察到HBx對肝癌細胞的促遷移侵襲能力消失,提示HBx通過抑制PPM1a促進肝癌細胞遷移和侵襲。(4)HBx通過促進PPM1a的泛素化降解實現對PPM1a的抑制:RT-PCR和Realtime PCR的結果都顯示HBx不影響PPM1a的mRNA水平,提示HBx對PPM1a的抑制作用是轉錄后水平。Western Blot的結果提示在細胞中加入蛋白酶體抑制劑MG-132后HBx對PPM1a的抑制作用消失,提示HBx對PPM1a的下調依賴蛋白酶體途徑。免疫共沉淀實驗的結果表明,在TGF-β信號通路活化的狀態(tài)下,HBx可以明顯增強PPM1a的泛素化水平。以上結果共同證實了 HBx通過增加PPM1a的泛素化-蛋白酶體降解途徑下調PPM1a的蛋白水平。(5)肝癌組織芯片免疫組化證實HBx在體內對PPM1a的抑制:同一批患者的3套肝癌組織芯片分別做免疫組化檢測HBx、PPM1a和pSmad3的表達。首先,可以觀察到PPPM1a與pSmad3表達成負相關,提示PPM1a在體內可以特異性終止TGF-β信號通路;其次,PPM1a在腫瘤組織中表達明顯低于癌旁,提示PPM1a是一種抑癌蛋白。最重要的是,在肝癌組織芯片中觀測到PPM1a與HBx的表達成明顯負相關系,提示在體內HBx下調PPM1a。綜上所述,我們發(fā)現了乙肝病毒HBV誘導肝癌的新的分子機制,即病毒蛋白HBx通過促進磷酸酶PPM1a的降解過度激活TGF-β信號通路,進而促進肝癌轉移。我們的研究結果為肝癌的治療提供了新的可行的藥物靶點,有望促進肝癌的靶向治療。第二部分:PD-1通過抑制NK細胞的抗腫瘤免疫導致消化道腫瘤患者不良預后消化道腫瘤惡性程度高,對現有治療方法不敏感,嚴重危害了人類的健康,研究消化道腫瘤的發(fā)病機制并尋找相關藥物靶點尤為重要。消化道腫瘤是炎癥相關腫瘤,隨著腫瘤的發(fā)生發(fā)展,T淋巴細胞,NK細胞等大量免疫細胞浸潤進入腫瘤微環(huán)境中。研究發(fā)現,這些免疫細胞已經喪失其對腫瘤細胞的殺傷功能,是一群功能受損的免疫細胞,研究免疫細胞功能受損的機制并恢復其對腫瘤的殺傷作用具有重要意義。PD-1是近年來發(fā)現的新型免疫檢查點分子,腫瘤微環(huán)境內T細胞表面高表達PD-1,腫瘤細胞表面高表達其配體PD-L1,PD-L1與PD-1結合后能抑制T細胞的活化。阻斷PD-1和PD-L1的結合可以恢復T細胞功能,促進T細胞對腫瘤細胞的殺傷。多種靶向PD-1/PD-L1的阻斷性抗體已經被研發(fā)出來并在臨床上取得了良好的治療效果。NK細胞是固有免疫的重要組成部分,可以直接殺傷腫瘤細胞。同T細胞類似,消化道腫瘤患者體內NK細胞的功能也是受到抑制的,但是機制不甚明了。研究發(fā)現,健康人體內NK細胞表面基本沒有PD-1表達,但是在一些感染相關疾病中NK上PD-1是高表達的,提示PD-1可能參與NK細胞功能調控,但是在腫瘤模型中的研究依然不足。本研究主要在消化道腫瘤模型中探索PD-1是否調控NK細胞腫瘤殺傷功能,并取得了以下研究成果。(1)NK細胞表面PD-1的表達與臨床消化道腫瘤患者預后的關系:流式細胞術檢測消化道腫瘤患者外周血NK細胞上PD-1的表達水平并分析其與預后的關系。和健康人相比,消化道腫瘤患者外周血NK表面PD-1表達升高,且NK上PD-1表達越高提示患者腫瘤分化程度越低、TNM分級越差同時存在淋巴結轉移。免疫熒光及流式細胞術檢測消化道腫瘤患者腫瘤浸潤NK細胞上PD-1的表達情況并分析其與患者生存期之間的關系,肝癌患者的腫瘤浸潤NK細胞上PD-1表達較癌旁高,且腫瘤浸潤NK細胞上PD-1表達水平越高,患者生存期越短(2)PD-1對NK細胞抗腫瘤免疫功能的調控:流式細胞術檢測NK細胞表面PD-1的表達與細胞表面抑制性標志和活化性標志的關系,發(fā)現PD-1+NK細胞傾向于表達較高水平的NKG2D和較低水平的NKG2A。同時給予NK細胞細胞因子等活化性刺激,發(fā)現PD-1的表達隨著刺激時間逐步升高,和PD-1-NK細胞相比,PD-1+ NK細胞分泌IFN-y的能力更強,和脫顆粒相關的標志CD107a的表達更高,這些結果共同提示PD-1表達在活化的NK細胞表面。利用抗體阻斷的方法研究PD-1對NK細胞功能的調控,在培養(yǎng)基中提前加入PD-1和PD-L1的阻斷性抗體封閉PD-1與PD-L1的結合,發(fā)現可增強NK細胞的功能,提示PD-1抑制了 NK細胞的功能。(3)PD-1和其配體PD-L1結合后調控NK細胞凋亡:利用Annexin-V標記凋亡細胞并用流式細胞術檢測細胞凋亡比率,發(fā)現本底狀態(tài)下PD-1+NK細胞更容易凋亡。在培養(yǎng)板底部包被PD-1的抗體,與NK細胞表面的PD-1交聯(lián)激活PD-1,然后給予細胞活化性刺激,發(fā)現PD-1激活后可以明顯促進PD-1+NK細胞的凋亡,對PD-1-NK細胞凋亡無影響。在培養(yǎng)基中提前加入PD-L1的阻斷性抗體封閉PD-1的激活,然后給予細胞活化性刺激誘導凋亡,發(fā)現PD-L1阻斷性抗體可以明顯抑制PD-1+NK細胞的凋亡,而對PD-1-NK細胞的凋亡無影響。以上結果共同證實激活NK細胞表面的PD-1可以促進NK細胞的凋亡。(4)Western Blot的方法研究PD-1參與NK功能調控的機制:利用人NK細胞系NK92細胞研究PD-1參與調控NK功能的下游信號通路。在NK92細胞的培養(yǎng)基中提前加入PD-1或者PD-L1的阻斷性抗體封閉PD-1與PD-L1的結合,然后給予NK92活化性刺激或者是腫瘤細胞刺激,Western Blot檢測NK92細胞中PI3K/AKT信號通路的激活情況,結果顯示封閉PD-1/PD-L1后,NK92細胞中AKT總量不變,但是磷酸化水平明顯增強,提示PD-1與其配體PD-L1結合后,通過抑制其下游PI3K/AKT信號通路實現對NK細胞功能的抑制。(5)利用荷瘤動物模型體內驗證體外實驗的結果:給予荷瘤裸鼠腹腔注射PD-1阻斷性抗體,可以抑制小鼠體內腫瘤的生長,同時發(fā)現此時小鼠體內NK細胞活性增強。敲除裸鼠體內NK細胞,PD-1阻斷性抗體對腫瘤抑制的作用消失,提示PD-1阻斷性抗體是通過提高NK功能發(fā)揮其腫瘤治療作用。本研究首次從臨床和基礎兩方面證實了 PD-1在腫瘤模型中對NK細胞功能的調控。已發(fā)表的研究證實多種消化道腫瘤高表達PD-L1,以及PD-1參與調節(jié)消化道腫瘤免疫微環(huán)境中T細胞耗竭,我們的研究結果補充了 PD-1對消化道腫瘤患者機體固有免疫的調節(jié),進一步提示了靶向于PD-1/PD-L1免疫檢查點的免疫治療應用于消化道腫瘤患者的可行性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

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本文編號：1500305