本文關(guān)鍵詞： CDK9抑制劑 下咽鱗狀細(xì)胞癌 凋亡 髓細(xì)胞白血病-1蛋白 化療增敏　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景和目的下咽鱗狀細(xì)胞癌(Hypopharyngeal Squamous Cell Carcinoma,HSCC)是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma,HNSCC)中惡性程度較高的一種。該腫瘤具有早期診斷困難、分化差、易發(fā)生粘膜下擴散及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等特點,因此,患者預(yù)后極差,5年生存率僅為20-40%。手術(shù)聯(lián)合放、化療是目前該疾病的主要治療手段。雖然以順鉑為基礎(chǔ)藥物的化療方案在保留患者喉功能以及延長患者生存時間等方面具有一定的作用,但是敏感性差且易產(chǎn)生耐藥性仍然是該腫瘤化療的一大瓶頸。因此,尋找改善下咽鱗狀細(xì)胞癌化療敏感性的藥物或方法,可能是提高該疾病治療水平的一種途徑。髓細(xì)胞白血病-1(Myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)蛋白是B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白家族中重要的抗凋亡成員之一。Mcl-1在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的高表達狀態(tài),與腫瘤細(xì)胞的生存維持以及放、化療抵抗性等密切相關(guān)。研究表明,某些藥物或其他因素誘導(dǎo)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的機制與Mcl-1的表達下調(diào)或功能受抑制密切相關(guān)。而且,通過反義RNA技術(shù)等降低Mcl-1的表達,可以提高頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對順鉑、5-FU等藥物的敏感性。上述研究提示我們,可以將靶向Mcl-1的藥物或方法引入到下咽鱗狀細(xì)胞癌的治療中。近年來,學(xué)者們創(chuàng)新性提出,可以通過尋找抑制Mcl-1轉(zhuǎn)錄的方法來降低其表達。RNA聚合酶Ⅱ(RNApolymeraselⅡ,RNAPⅡ)在Mcl-1等基因轉(zhuǎn)錄啟動及延伸的過程中發(fā)揮著重要作用。而RNP Ⅱ的活化需要受到上游多個分子的調(diào)控,其中正向轉(zhuǎn)錄延伸因子 b(The positive transcriptional elongation factor b,p-TEFb)磷酸化RNPⅡ羧基末端結(jié)構(gòu)域內(nèi)七肽重復(fù)序列中的第二位絲氨酸(phospho-RNAP Ⅱser2,p-RNAP Ⅱs2)是十分關(guān)鍵的一步。通過 p-RNAP Ⅱs2,RNAPⅡ能夠有效地促進RNA延伸。在p-TEFb的組成成分中,細(xì)胞周期依賴性激酶9/周期蛋白 T(cyclin-dependent kinase 9/cyclin T,CDK9/cyclin T)是磷酸化 RNAPⅡ的核心亞基。因此,學(xué)者們提出,可以通過抑制CDK9來降低Mcl-1等基因的轉(zhuǎn)錄及表達。近十幾年以來,學(xué)者們已研發(fā)出多種CDK9抑制劑,其中南澳大學(xué)Shudong Wang教授團隊合成的CDKI-73是目前活性最強的CDK9抑制劑之一(抑制常數(shù)Ki=3nM)。與其他CDK9抑制劑相比,CDKI-73具有對正常細(xì)胞毒性小、靶向性強等優(yōu)勢。在對慢性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓系細(xì)胞白血病及卵巢癌治療作用的評價中,CDKI-73顯示了良好的殺傷腫瘤細(xì)胞的能力,但對正常細(xì)胞的毒性很小。目前,該化合物正處于申報澳大利亞及國內(nèi)一期臨床試驗階段,具有良好的應(yīng)用前景。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中Mcl-1呈轉(zhuǎn)錄活躍的狀態(tài),且其mRNA表達水平與腫瘤的大小相關(guān),這提示我們,與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌一致,Mcl-1可能也是維持下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生存并導(dǎo)致其對順鉑不敏感的一個因素。據(jù)此,我們推測,CDK9抑制劑在抑制下咽鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞生長及增強其化療敏感性方面可能具有一定的作用。而目前尚無關(guān)于CDK9抑制劑在下咽鱗狀細(xì)胞癌中治療作用的報道。因此,我們繼續(xù)通過體外實驗評估了 CDKI-73對下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長及化療敏感性的影響,并對相關(guān)機制進行了初步的探索,以期為下咽鱗狀細(xì)胞癌的臨床治療提供新的候選藥物。研究目的1.通過對下咽鱗狀細(xì)胞癌中Mcl-1轉(zhuǎn)錄水平的檢測,明確CDKI-73在下咽鱗狀細(xì)胞癌治療中潛在的應(yīng)用價值;2.研究CDKI-73對下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長的影響及其相關(guān)機制;3.探索CDKI-73能否增強下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。研究方法和結(jié)果1.與癌旁正常粘膜組織相比,下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中Mcl-1在mRNA水平上呈高表達狀態(tài)為檢測Mcl-1在下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中的轉(zhuǎn)錄情況,我們收集了 57例下咽鱗狀細(xì)胞癌患者的腫瘤組織標(biāo)本及31例癌旁正常粘膜組織標(biāo)本。運用Real-time PCR技術(shù),對上述組織標(biāo)本中Mcl-1 mRNA的表達水平進行了檢測。結(jié)果顯示,與癌旁正常粘膜組織相比,起源于·梨狀窩(36例)、喉咽后壁(13例)及環(huán)后區(qū)(8例)的下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中Mcl-1在mRNA水平上均表達上調(diào)(p0.01)。由此可知,Mcl-1基因在下咽鱗狀細(xì)胞癌中轉(zhuǎn)錄活躍。我們進一步分析了腫瘤組織中Mcl-1 mRNA的表達水平與患者臨床特征之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)Mcl-1 mRNA的表達水平與腫瘤大小(p = 0.01)及患者的臨床分期(p = 0.017)密切相關(guān)。在體積較大(最大徑超過2cm)或臨床分期(Ⅲ-Ⅳ期)較晚的患者的腫瘤組織中,Mcl-1 mRNA的表達水平顯著上調(diào),提示在下咽鱗狀細(xì)胞癌中,Mcl-1可能具有維持腫瘤細(xì)胞生存的作用。2.CDKI-73具有抑制FaDu細(xì)胞增殖的作用研究顯示,CDK9抑制劑對Mcl-1高表達的腫瘤具有良好的抗增殖作用。因此,我們進一步探索了 CDKI-73對人下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系——FaDu細(xì)胞的體外藥理作用。在正常培養(yǎng)條件下,用不同濃度的CDKI-73分別處理FaDu細(xì)胞和HEK293細(xì)胞(即人胚腎細(xì)胞)。24小時及48小時后,利用CCK8(Cell Counting Kit-8,CCK8)實驗檢測細(xì)胞存活率。實驗結(jié)果顯示,隨著藥物濃度增加或者藥物作用時間延長,FaDu細(xì)胞的細(xì)胞存活率逐漸下降。而在相同的條件下,HEK293細(xì)胞存活率的下降程度均明顯低于FaDu細(xì)胞(p0.05或p0.01)。CDKI-73作用24小時及48小時,FaDu細(xì)胞及HEK293細(xì)胞的IC50分別為5.77± 2.87μM vs.66.96 ± 25.66 μM(24 小時,p= 0.01)、0.86 ±0.33 μM vs.8.82 ±4.64 μM(48小時,p0.01)。由此可見,CDKI-73對FaDu細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用,且與正常細(xì)胞相比,CDKI-73對FaDu細(xì)胞的抑制作用更強。3.CDKI-73通過誘導(dǎo)凋亡及阻滯細(xì)胞周期來抑制FaDu細(xì)胞的增殖接下來,我們首先觀察了 CDKI-73是否通過誘導(dǎo)凋亡來抑制FaDu細(xì)胞的增殖。Caspase-3活性檢測實驗顯示,caspase-3的活化程度隨CDKI-73濃度的遞增而顯著升高。而且,作為caspase-3的剪切對象,多腺苷二磷酸多聚酶(poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)被剪切程度也隨CDKI-73濃度的升高而增強。同時,我們通過Annexin V-FITC/PI雙染法凋亡檢測實驗,發(fā)現(xiàn)升高CDKI-73的濃度或者延長CDKI-73的作用時間,均可引起FaDu細(xì)胞凋亡比率的增加,且在相同的處理條件下,FaDu細(xì)胞凋亡比率與CCK8實驗結(jié)果相近。以上結(jié)果均提示,CDKI-73主要通過誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞凋亡來抑制其增殖。同樣地,在人咽癌胸水轉(zhuǎn)移細(xì)胞系——Detroit 562細(xì)胞系中,CDKI-73也呈劑量依賴性地激活caspase-3,并且呈時間-劑量依賴性地增加凋亡細(xì)胞比率,進一步證實了 CDKI-73對咽部惡性腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用。其次,我們探索了 CDKI-73是否可以阻礙FaDu細(xì)胞的細(xì)胞周期進而影響其增殖。利用細(xì)胞周期檢測實驗,我們發(fā)現(xiàn),與0μM相比,低濃度(0.25 μM)的CDKI-73可以顯著地提高G0/G1期細(xì)胞比率(65.18±3.12%vs 46.13±2.22%,p0.01),而降低 S 期細(xì)胞比率(25.29±3.16%vs.46.11 ±2.54%,p0.01)。因此,我們認(rèn)為CDK丨-73還可以通過阻滯FaDu細(xì)胞周期進程來抑制其增殖。4.CDKI-73 在 FaDu 細(xì)胞中的作用模式(Mode of action,MoA)進一步,我們對CDKI-73在FaDu細(xì)胞中的作用機制進行了探索。我們用不同濃度的CDKI-73處理FaDu細(xì)胞。24小時后,通過Western blot的方法對CDK9及其下游分子的磷酸化、表達情況進行了檢測。實驗結(jié)果顯示,隨著CDKI-73濃度的增加,CDK9磷酸化受到明顯的抑制,相應(yīng)地,其下游的RNAP Ⅱ的磷酸——p-RNAP Ⅱs2也被顯著減弱。而p-RNAP Ⅱs2是CDK9的生物活性標(biāo)志物,因此上述結(jié)果提示CDKI-73能夠抑制CDK9的功能。另外,上述處理也顯著降低了 FaDu細(xì)胞中Mcl-1蛋白的表達水平。進一步,我們觀察了 CDKI-73是否通過影響Mcl-1的轉(zhuǎn)錄而降低Mcl-1的表達。用不同濃度的CDKI-73處理FaDu細(xì)胞12小時,Real-time PCR實驗顯示,RNAP Ⅱ下游的三個基因——Mcl-1、Bcl-2及 X 連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)的 mRNA 表達水平呈劑量依賴性地降低,其中Mcl-1 mRNA降低程度最為顯著,其次為Bcl-2 mRNA。上述發(fā)現(xiàn),在Detroit 562細(xì)胞中也得到了驗證。由此可見,CDKI-73可以通過抑制CDK9、RNAP Ⅱ,進而降低下游Mcl-1等基因的轉(zhuǎn)錄和表達。為明確Mcl-1對CDKI-73的抑制作用更加敏感,我們給予FaDu細(xì)胞低劑量(0.5 μM)的CDKI-73,并在給藥后不同的時間點比較了 Mcl-1和Bcl-2兩個基因的轉(zhuǎn)錄情況,發(fā)現(xiàn)Mcl-1 mRNA的表達水平較Bcl-2降低地更加迅速(p0.01)。由此可知,在下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中,Mcl-1對CDKI-73的抑制作用更加敏感。5.CDKI-73的作用模式可能是其誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞凋亡的機制為明確CDK9是否為CDKI-73誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞凋亡的靶點,我們將CDK9的小干擾RNA(分別標(biāo)記為S1和S2)及無關(guān)序列對照(scrambled nucleotide,SN)分別轉(zhuǎn)染進入FaDu細(xì)胞,以觀察干擾CDK9的表達對FaDu細(xì)胞的影響。Western blot及Real-time PCR結(jié)果顯示,干擾CDK9的表達能夠抑制RNAP Ⅱ丨的磷酸化、Mcl-1的轉(zhuǎn)錄及表達,進一步證實了 CDKI-73是通過抑制CDK9來降低Mcl-1的轉(zhuǎn)錄和表達。更重要的是,Annexin V-FITC/PI雙染法凋亡檢測實驗結(jié)果顯示,干擾CDK9的表達可以引起FaDu細(xì)胞凋亡比率的增加(S1 v.SN,19.69±4.09%vs.9.49±2.53%,p0.05;S2 vs.SN,22.25 ±3.41%vs.9.49±2.53%,p0.05),說明了 CDK9很可能是CDKI-73發(fā)揮促凋亡作用的靶點。另有研究證實,降低Mcl-1的表達或抑制其功能均可以誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞凋亡。因此,通過抑制CDK9,進而降低Mcl-1的表達,很可能是CDKI-73誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞凋亡的機制。6.CDKI-73能夠增強FaDu細(xì)胞對順鉑的敏感性Mcl-1的高表達是影響頭頸部鱗狀細(xì)胞癌化療敏感性的重要因素。而CDKI-73能夠有效降低FaDu細(xì)胞中Mcl-1轉(zhuǎn)錄及表達,因此,我們進一步探索了 CDKI-73能否增強FaDu細(xì)胞對順鉑的敏感性。聯(lián)合指數(shù)(Combination Index,CI)是評價兩種藥物聯(lián)用時藥物之間相互作用關(guān)系的重要方法。CI1,表示兩藥具有拮抗作用;CI1,表示兩藥具有協(xié)同作用;而CI=1,表示兩藥僅有相加作用。據(jù)此,我們通過計算CI以評價CDKI-73與順鉑的關(guān)系。我們選取了一個能夠顯著降低FaDu細(xì)胞中Mcl-1表達但不會引起過多細(xì)胞凋亡的濃度,即0.25 μM。用不同濃度的順鉑單獨或者與0.25 μM CDKI-73聯(lián)合處理FaDu細(xì)胞。48小時后,利用CCK8實驗,我們獲得了 CDKI-73、順鉑單用及兩藥聯(lián)合情況下的細(xì)胞增殖抑制率,并將數(shù)據(jù)輸入專門用于計算CI的軟件——CompuSyn program。計算結(jié)果顯示,0.25 μM CDKI-73與不同濃度順鉑聯(lián)用的CI均小于1,提示CDKI-73和順鉑在抗FaDu細(xì)胞增殖方面具有協(xié)同作用,也說明CDKI-73在改善FaDu細(xì)胞對順鉑的敏感性方面具有一定作用。另外,我們用Annexin V-FITC/PI雙染法,對0.25 μM CDKI-73、1 μM順鉑單用或兩藥聯(lián)用情況下的細(xì)胞凋亡比率進行了檢測和比較。結(jié)果顯示,CDKI-73與順鉑聯(lián)合運用對FaDu細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用(54.4 ± 8.3%)顯著強于CDKI-73(20.6 ± 3.0%,p0.01)及順鉑(24.7± 5.9%,p0.01)單藥運用,進一步驗證了兩種藥物的協(xié)同作用。研究結(jié)論1.Mcl-1在下咽鱗狀細(xì)胞癌中存在轉(zhuǎn)錄活躍的現(xiàn)象,而且腫瘤組織中Mcl-1 mRNA的表達水平與患者的腫瘤大小及臨床分期密切相關(guān)。該現(xiàn)象提示,Mcl-1可能在下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生存維持及化療不敏感性等方面中具有一定作用,且CDK9抑制劑可能對下咽鱗狀細(xì)胞癌的治療具有一定的應(yīng)用價值。2.CDKI-73具有選擇性抑制FaDu細(xì)胞增殖的功能,且主要通過誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞凋亡的途徑。其次,阻滯細(xì)胞周期也有助于CDKI-73抑制FaDu細(xì)胞的增殖。由此可見,CDKI-73單藥可能對下咽鱗狀細(xì)胞癌具有治療作用。3.通過抑制CDK9,進而降低Mcl-1的轉(zhuǎn)錄和表達,很可能是CDKI-73誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞發(fā)生凋亡的機制。4.體外實驗證實,在抑制FaDu細(xì)胞增殖方面,CDKI-73和順鉑具有協(xié)同作用,提示CDKI-73能夠增加下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R739.63

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7 李U，

本文編號：1499728