本文關(guān)鍵詞： 急性髓系白血病 淋巴細胞特異連接蛋白 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化蛋白3 THP-1細胞 基因沉默 急性髓系白血病 青蒿琥酯 THP-1細胞 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化蛋白3　出處：《遵義醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一類非常常見的造血干細胞惡性克隆性疾病,其發(fā)病機制十分復(fù)雜,具有高度異質(zhì)性,總體預(yù)后不佳。LNK基因主要表達在造血細胞和組織上,在維持正常造血穩(wěn)定的過程中有著不可替代的作用,參與了JAK/STAT(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription)等多條信號通路的調(diào)控。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化蛋白3(signal transducerand activator of transcription 3,STAT3)是JAK/STAT信號通路中LNK基因的下游基因,是公認(rèn)的致癌轉(zhuǎn)錄因子,參與了多種癌癥和白血病的發(fā)生發(fā)展。本研究旨在了解急性髓系白血病患者中LNK基因、STAT3基因表達情況;探討LNK基因沉默后對人急性單核細胞白血病THP-1細胞增殖的影響及對其下游基因STAT3的影響。方法:選取2015年1月--2016年1月間在我院初診的AML患者30例為病例組,同期住院的非惡性疾病患者20例為對照組,分別收集骨髓2ml。提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄為c DNA,設(shè)計LNK、STAT3基因引物,采用RT-PCR檢測病例組和對照組LNK m RNA、STAT3 m RNA表達情況;提取蛋白,采用Western Blotting檢測LNK、STAT3蛋白表達情況。培養(yǎng)THP-1細胞,以慢病毒為載體介導(dǎo)si RNA穩(wěn)定沉默LNK基因;流式細胞術(shù)檢測感染率;RT-PCR驗證LNK沉默效應(yīng);CCK-8法檢測THP-1細胞增殖情況;Western Blotting檢測LNK、STAT3蛋白表達情況。結(jié)果:RT-PCR結(jié)果顯示,AML患者的LNK m RNA和STAT3 m RNA水平較對照組均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);Western Blotting結(jié)果顯示,AML患者的LNK和STAT3蛋白表達水平明顯高于對照組(P0.05),說明AML患者存在LNK和STAT3基因的高表達。LNK si RNA-EGFP重組慢病毒感染THP-1細胞的最佳MOI=100,在感染72小時時綠色熒光蛋白表達最強;流式細胞術(shù)檢測各組感染效率均在95%以上,說明慢病毒感染THP-1細胞成功;RT-PCR檢測各組LNK m RNA表達情況,結(jié)果顯示,與對照組相比,空病毒組無明顯改變(P0.05),各感染組LNK m RNA均顯著下降(P0.05),提示LNK基因沉默成功;采用CKK-8法檢測各組細胞增殖情況,與對照組相比,空病毒組細胞增殖無明顯改變(P0.05),感染組細胞增殖速率明顯下降(P0.05);Western Blotting結(jié)果顯示,與對照組相比,空病毒組LNK、STAT3蛋白表達無明顯改變(P0.05),感染組則顯著下降(P0.01),沉默LNK后,LNK蛋白表達下降,同時伴有STAT3蛋白的下降,說明在THP-1細胞中,LNK表達的下降影響STAT3基因的表達,LNK基因?qū)TAT3表達可能有促進作用。結(jié)論:1.AML患者中存在LNK、STAT3基因的高表達;2.以慢病毒為載體,采用si RNA技術(shù)可以成功沉默THP-1細胞的LNK基因;3.LNK沉默后,THP-1細胞增殖明顯受阻,提示LNK基因可以促進急性髓系白血病細胞的增殖;4.LNK沉默后,STAT3蛋白表達顯著下調(diào),提示LNK基因可能影響STAT3的表達;目的:急性髓系白血病(AML)是一類惡性程度較高的血液腫瘤,目前的治療主要以化療為主。近年來,隨著對急性髓系白血病發(fā)病機制認(rèn)識的深入,各種聯(lián)合化療方案和支持治療的日益完善,急性髓系白血病的預(yù)后有所改觀。但是,化療藥物的多重耐藥性、副作用等一系列問題,使得當(dāng)前急性髓系白血病的治療依然存在較大的困難,為此迫切需要尋找新的安全高效、少耐藥、不良反應(yīng)輕微的藥物。青蒿琥酯(Artesunate,ART)是青蒿素的一種半合成衍生物,已在臨床應(yīng)用20余年,具有水溶性好,抗瘧療效高、安全性高等特點。近年研究表明,青蒿琥酯對多種腫瘤細胞有抗癌作用。本研究旨在探討青蒿琥酯對急性髓系白血病是否具有抗白血病作用及其作用機制,為急性髓系白血病的治療尋找新的藥物。方法:培養(yǎng)THP-1細胞,選用5種濃度的青蒿琥酯處理THP-1細胞后,采用CCK-8法檢測THP-1細胞的活力,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況,Western Blotting檢測STAT3、caspase3、caspase8蛋白表達。將5周齡裸鼠隨機分為實驗組及對照組,實驗組頸部皮下注射對數(shù)生長期的THP-1細胞1.5′106個/只,對照組頸部皮下注射PBS 0.1ml/只;待裸鼠皮下成瘤后,藥物干預(yù)組腹腔注射不同濃度青蒿琥酯,生理鹽水組腹腔注射等量生理鹽水,觀察瘤體的變化;待青蒿琥酯治療結(jié)束1周后,處死裸鼠,取瘤體組織提取蛋白,Western Blotting法檢測STAT3蛋白表達情況。結(jié)果:青蒿琥酯能明顯抑制體外THP-1細胞的增殖,其效應(yīng)呈劑量及時間依賴性;流式細胞術(shù)結(jié)果顯示青蒿琥酯能增加THP-1細胞的凋亡;Western Blotting結(jié)果顯示,青蒿琥酯顯著下調(diào)STAT3蛋白表達,同時激活capase3和caspase8從而誘導(dǎo)細胞凋亡;實驗組裸鼠接種THP-1細胞后4周皮下成瘤;與生理鹽水組相比,腹腔注射青蒿琥酯能顯著抑制瘤體的生長,且沒有明顯的不良反應(yīng)。瘤體組織Western Blotting結(jié)果顯示,青蒿琥酯下調(diào)了STAT3蛋白表達(P0.05)。結(jié)論:1.青蒿琥酯能夠顯著抑制THP-1細胞的增殖,提示青蒿琥酯對AML有抗白血病作用;2.青蒿琥酯作用于THP-1細胞后,STAT3蛋白表達下降,凋亡蛋白caspase3和caspase8表達上調(diào),提示青蒿琥酯可能是通過下調(diào)STAT3基因的表達和激活caspase3和caspase8從而發(fā)揮抗白血病作用。3.THP-1細胞能在裸鼠皮下成瘤,青蒿琥酯腹腔注射有效抑制瘤體的生長,提示ART對THP-1細胞在體內(nèi)亦有抗白血病作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R733.71

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本文編號：1493302