本文關(guān)鍵詞： 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞 侵襲 細(xì)胞運(yùn)動(dòng) Notch 信號(hào)通路 肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架 Arp2/3復(fù)合體　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)分子—Arp2/3復(fù)合體對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移至關(guān)重要,促進(jìn)腫瘤侵襲。本研究旨在研究肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架是否參與維持干細(xì)胞表型,及其干細(xì)胞表型維持過程中的作用。內(nèi)容:探究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在原發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的存在和分布形式。研究干細(xì)胞標(biāo)志物在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的表達(dá)水平,評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更新能力。檢測Arp2/3復(fù)合體是否參與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表型的維持,以及潛在調(diào)控機(jī)制。方法:收集14例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者腫瘤中心區(qū)域的組織標(biāo)本,利用免疫組織化學(xué)染色檢測干細(xì)胞標(biāo)志物(CD133,Nestin,Notch1和Delta-like1)和細(xì)胞分化標(biāo)志物(GFAP和Tu J1)在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平和分布情況。免疫磁珠分選技術(shù)富集CD133+U87-MG和U251-MG膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,采用三維膠質(zhì)瘤細(xì)胞球培養(yǎng)獲得具有自我更新能力的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。Western blot、免疫熒光染色和單細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)分別用來檢測干細(xì)胞標(biāo)志物在體外CD133+膠質(zhì)瘤細(xì)胞球中的表達(dá)及其自我更新能力。綜合干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平和自我更新能力評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表型。利用慢病毒載體shRNA敲低Delta-like1(DLL1)和Arp2,以及Arp2/3復(fù)合體特異性抑制劑CK636,探究其對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表型維持的作用。同時(shí)應(yīng)用分離亞細(xì)胞蛋白的Western blot和免疫熒光染色檢測敲低Arp2對(duì)DLL1亞細(xì)胞定位的影響。建立顱內(nèi)原位種植穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的CD133+U87-MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞的裸鼠模型,驗(yàn)證敲低Arp2對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響。結(jié)果:原發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者腫瘤標(biāo)本中,CD133+、Nestin+、Notch1+和DLL1+腫瘤干細(xì)胞聚集形成管狀結(jié)構(gòu),GFAP+和TuJ1+腫瘤細(xì)胞呈片狀聚集于遠(yuǎn)離上述管狀結(jié)構(gòu)的區(qū)域,進(jìn)一步的免疫熒光染色顯示Notch1和DLL1共表達(dá)于上述腫瘤干細(xì)胞,部分位于管狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的DLL1+腫瘤細(xì)胞同時(shí)表達(dá)內(nèi)皮標(biāo)志物CD31。體外實(shí)驗(yàn)中,流式細(xì)胞術(shù)檢測經(jīng)過免疫磁珠分選后的CD133+U87-MG細(xì)胞比例為84.70±2.70%,CD133+U251-MG細(xì)胞比例為74.23±2.43%。CD133+細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)基中形成三維膠質(zhì)瘤細(xì)胞球,Western blot和免疫熒光染色顯示CD133+膠質(zhì)瘤細(xì)胞球干性標(biāo)志物CD133和Nestin,Notch通路組分Notch1、NICD1和DLL1的表達(dá)水平顯著高于10%血清培養(yǎng)貼壁生長未經(jīng)篩選的膠質(zhì)瘤細(xì)胞,細(xì)胞分化標(biāo)志物GFAP和TuJ1的表達(dá)水平則顯著降低。shRNA敲低DLL1顯著降低U87-MG和U251-MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞球干性標(biāo)志物CD133和Nestin表達(dá),降低Notch通路活性(NICD1和HES1表達(dá)下降),GFAP和TuJ1表達(dá)水平顯著升高;shDLL1還顯著降低了膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的單細(xì)胞成球能力(p0.05)。shRNA敲低Arp2和抑制劑CK636抑制U87-MG和U251-MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞片狀偽足形成,同時(shí)顯著降低CD133、Nestin、NICD1和HES1,升高GFAP和TuJ1的表達(dá)水平,shArp2和CK636還還顯著降低了膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的單細(xì)胞成球能力(p0.05)。然而,同時(shí)敲低DLL1和Arp2未進(jìn)一步降低CD133、Nestin、NICD1和HES1,升高GFAP和TuJ1的表達(dá)水平,未進(jìn)一步降低單細(xì)胞成球能力,但外源可溶性DLL1卻恢復(fù)了敲低DLL1和Arp2引起的干細(xì)胞表型的缺失。潛在機(jī)制是Arp2/3復(fù)合體維持DLL1的亞細(xì)胞定位,Western blot和免疫熒光染色提示shArp2和CK636降低細(xì)胞膜上DLL1的表達(dá),增加了細(xì)胞質(zhì)中DLL1的表達(dá)。顱內(nèi)原位種植模型中,敲低Arp2顯著降低CD133+U87-MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞的致瘤能力。結(jié)論:Notch配體DLL1依賴于細(xì)胞骨架調(diào)控分子Arp2/3復(fù)合體,維持Notch通路活性,進(jìn)而維持膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表型。細(xì)胞骨架參與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞表型的調(diào)控過程,為靶向腫瘤侵襲遷移的治療策略提供理論支持和創(chuàng)新思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.41

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本文編號(hào)：1490009