發(fā)布時(shí)間：2018-02-04 05:16

  本文關(guān)鍵詞： 定量多色熒光原位雜交 卵巢癌 基因拷貝數(shù)變化 卵巢癌干細(xì)胞 MYC RB1　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：卵巢癌死亡率高居?jì)D科腫瘤的首位,治療策略為腫瘤減滅手術(shù)聯(lián)合以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化學(xué)治療。近年來雖然患者生存率有所提高,但約有80-85%的卵巢癌患者會(huì)復(fù)發(fā),并對(duì)化療藥物如順鉑產(chǎn)生耐受,五年生存率徘徊于30-40%。隨著細(xì)胞遺傳學(xué)與腫瘤病因?qū)W研究的不斷深入,各種研究顯示染色體不穩(wěn)定性即非整倍體和結(jié)構(gòu)重排(缺失、基因擴(kuò)增和易位)與腫瘤的形成和發(fā)展密切相關(guān)。然而針對(duì)卵巢癌相關(guān)的多基因拷貝數(shù)變化研究尚處于起步階段。定量多基因熒光原位雜交技術(shù),簡稱QM-FISH(Quantitative Multi-gene Fluorescencein situ Hybridization),QM-FISH技術(shù)關(guān)鍵在于基因組合探針設(shè)計(jì)、探針制備、標(biāo)本制備和分子雜交條件的優(yōu)化。相較于傳統(tǒng)的FISH技術(shù)信噪比提高了5-10倍,可以在同一時(shí)間內(nèi)定量單個(gè)腫瘤細(xì)胞核的多個(gè)基因(目前可同時(shí)定量20余個(gè)基因),且可以自由組合目的基因。該技術(shù)是尋找和確認(rèn)腫瘤臨床標(biāo)本的特異性等位基因失衡極其有效的工具,可以用于大規(guī)模研究臨床腫瘤標(biāo)本基因拷貝數(shù)的變化(等位基因失衡)。此外QM-FISH對(duì)確定腫瘤細(xì)胞耐藥亞群、疾病進(jìn)展時(shí)的克隆演變和識(shí)別腫瘤干細(xì)胞也有顯著的作用。本研究首次將QM-FISH技術(shù)應(yīng)用于卵巢癌的研究,以發(fā)現(xiàn)進(jìn)展期上皮性卵巢癌多基因拷貝數(shù)異常變化的規(guī)律。隨著細(xì)胞遺傳學(xué)與腫瘤病因?qū)W研究的不斷深入,各種研究顯示染色體不穩(wěn)定性即非整倍體和結(jié)構(gòu)重排(缺失、基因擴(kuò)增和易位)與腫瘤的形成和發(fā)展密切相關(guān)。包括比較基因組雜交等的卵巢癌基因組異常相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)包括MYC、RB1、CHEK2、TP53和BRCA1等一系列重要基因在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。因此我們?cè)谘芯恐性O(shè)計(jì)了包括該五個(gè)基因的探針組合,對(duì)合成探針?biāo)肂AC克隆進(jìn)行了鑒定,并使用外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)探針進(jìn)行了驗(yàn)證。該研究將用合成的探針應(yīng)用于卵巢癌標(biāo)本的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)圖像清晰,能夠獲得滿意的熒光信號(hào)強(qiáng)度和熒光信號(hào)強(qiáng)度/背景信號(hào)比值,信號(hào)分裂率低。由于臨床標(biāo)本種類較多,本研究進(jìn)一步將QM-FISH技術(shù)應(yīng)用于卵巢癌的多種標(biāo)本類型包括石蠟切片、冰凍切片、組織印片和細(xì)胞甩片,對(duì)各種標(biāo)本進(jìn)行對(duì)比并制定出相應(yīng)的標(biāo)本選擇策略。顯示出在各種標(biāo)本都能獲得的情況下,應(yīng)該首選使用冰凍切片,其次選用石蠟切片。在給予手術(shù)治療的患者中則應(yīng)選擇組織印片標(biāo)本。腹水陽性的進(jìn)展期卵巢癌患者無論病人手術(shù)與否都可直接使用腹水腫瘤細(xì)胞標(biāo)本甩片后進(jìn)行FISH檢測。研究的第二部分應(yīng)用自制的熒光標(biāo)記探針,分別在10名復(fù)發(fā)性進(jìn)展期上皮性卵巢癌患者的腹水腫瘤細(xì)胞標(biāo)本中檢測了myc、rb1、chek2、tp53和brca1共計(jì)5個(gè)基因的拷貝數(shù)異常。結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%的病例中出現(xiàn)了myc擴(kuò)增,40%的患者中發(fā)生了rb1缺失現(xiàn)象。針對(duì)出現(xiàn)頻率較高的myc擴(kuò)增和rb1缺失,將研究范圍擴(kuò)大至58例上皮性卵巢癌患者,通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在近三分之一的患者中同時(shí)出現(xiàn)了這兩種染色體異常。在卵巢癌石蠟切片的免疫組化和腹水細(xì)胞的western結(jié)果印證了myc擴(kuò)增造成蛋白表達(dá)水平上升。結(jié)合臨床病理資料和術(shù)后隨訪,研究發(fā)現(xiàn)在figoiii-iv期上皮性卵巢癌中rb1基因缺失明顯增加,低分化-未分化組的rb1基因缺失率較高分化-中分化組明顯增加。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)rb1基因缺失的患者生存期較不存在rb1基因缺失的患者顯著縮短。對(duì)比典型的復(fù)發(fā)性上皮性卵巢癌患者初診時(shí)和復(fù)發(fā)后的定量多色原位基因雜交結(jié)果,觀察到克隆演化現(xiàn)象的發(fā)生。復(fù)發(fā)后,亞克隆“4myc1rb”的比例由初診時(shí)的11.00%上升至27.59%,同時(shí)伴有2個(gè)亞克隆的新生。該研究提示rb1基因缺失可以作為指導(dǎo)卵巢癌分期和預(yù)測疾病預(yù)后的指標(biāo)之一。根據(jù)前兩部分研究工作結(jié)果,我們申請(qǐng)《一種檢測上皮性卵巢癌的基因探針組合物及試劑盒(201310106080.4)》獲得國家專利授權(quán)。該專利技術(shù)提供了一種檢測上皮性卵巢癌的基因探針組合物,包括myc基因探針、rb1基因探針、chek2基因探針、tp53基因探針和brca1基因探針,該技術(shù)可對(duì)上皮性卵巢癌同一樣本甚至上皮性卵巢癌單個(gè)腫瘤細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行5基因的檢測。該試劑盒可以用于確定上皮性卵巢癌的分子病理類型,判斷病情預(yù)后,指導(dǎo)個(gè)體化治療,評(píng)估臨床治療效果,監(jiān)測病灶復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。卵巢癌干細(xì)胞,與該腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、復(fù)發(fā)、耐藥、常見種植轉(zhuǎn)移等現(xiàn)象密切相關(guān)。因此本研究的第三部分利用流式細(xì)胞術(shù)分選腹水腫瘤細(xì)胞中aldh陽性亞群富集卵巢癌干細(xì)胞,對(duì)aldh陽性細(xì)胞使用卵巢癌干細(xì)胞培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)可獲得成球細(xì)胞,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光染色鑒定成球細(xì)胞具有卵巢癌干細(xì)胞表型。定量多色原位基因雜交顯示,在復(fù)發(fā)性卵巢癌患者腹水腫瘤干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞相比,亞克隆數(shù)較少,且染色體變異程度較低。myc出現(xiàn)了不同程度的拷貝數(shù)增加。發(fā)現(xiàn)1例患者在不同的亞克隆中分別出現(xiàn)brca1、tp53、chek2、rb1缺失的多種組合。由于在上皮性卵巢癌干細(xì)胞水平確認(rèn)了myc和rb1的染色體異常,本研究的第四部分進(jìn)一步擴(kuò)大研究范圍,利用芯片數(shù)據(jù),對(duì)比上皮性卵巢癌干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的表達(dá)譜,篩選出若干腫瘤干細(xì)胞水平特異的表達(dá)譜變化。對(duì)其信號(hào)通路的分析發(fā)現(xiàn),ErbB通路往往出現(xiàn)整體異常。以這些異常表達(dá)基因?yàn)榛A(chǔ),在CMAP數(shù)據(jù)庫中篩選出18種已知的小分子藥物。其中某些小分子已經(jīng)在其他腫瘤中展現(xiàn)出治療效果,部分克服了腫瘤細(xì)胞的抗藥性,這些小分子有望在卵巢癌治療中發(fā)揮作用。
[Abstract]:In recent years , it has been shown that chromosome instability , i.e . , non - euploid and structural rearrangement ( deletion , gene amplification and translocation ) plays an important role in the development of ovarian cancer . This study suggests that the deletion of rb1 gene can be used as one of the markers to guide ovarian cancer staging and prognosis of ovarian cancer .

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.31

【引證文獻(xiàn)】

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1 孫雪梅;;急性髓性白血病多步驟發(fā)病機(jī)理與分子靶向治療[A];第10屆全國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要匯編[C];2005年

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本文編號(hào)：1489429