發(fā)布時(shí)間：2018-02-02 16:25

  本文關(guān)鍵詞： miRNA-141 結(jié)直腸癌 生物學(xué)功能 生物信息學(xué) 靶基因　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：在我國(guó),結(jié)直腸癌是非常常見(jiàn)的惡性消化系統(tǒng)腫瘤,近20年來(lái)尤其在大城市,發(fā)病率明顯上升,據(jù)《2015年中國(guó)腫瘤登記年報(bào)》發(fā)布數(shù)據(jù),結(jié)直腸癌的發(fā)病率已超過(guò)肝癌,僅次于肺癌和胃癌,在惡性腫瘤中排列第三;在惡性腫瘤的死亡率排列第五,次于肺癌、肝癌、胃癌和食管癌。在國(guó)內(nèi),結(jié)直腸癌的早期診斷率仍然很低,約60%的患者為中晚期。除此之外,結(jié)直腸癌呈現(xiàn)出患病人數(shù)多及較低的5年生存率等特征。上述,也是結(jié)直腸癌成為癌癥患者主要死因的根源。手術(shù),可以說(shuō)是結(jié)直腸癌有望治愈的唯一方式。然而,很多患者即便接受過(guò)結(jié)直腸癌根治術(shù),還是可能再次復(fù)發(fā)甚至是轉(zhuǎn)移。術(shù)后,采取輔助放化療方案來(lái)對(duì)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行治療,或可減少?gòu)?fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)晚期結(jié)直腸癌患者來(lái)說(shuō),化療在綜合性治療中同樣起著極為關(guān)鍵的作用。但是,結(jié)直腸癌患者在化療期間,始終會(huì)有無(wú)法回避的問(wèn)題——耐藥。由此可見(jiàn):越早對(duì)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行規(guī)范化診治,其5年生存率越能得以提高。因此,探索敏感性較強(qiáng)的分子標(biāo)志物,找到分子靶標(biāo)和做好預(yù)后評(píng)估,這是十分重要的。mi RNA屬于重要的非編碼小分子RNA,在機(jī)體中呈現(xiàn)內(nèi)源性表達(dá),其長(zhǎng)度約為18-25個(gè)核苷酸。人類(lèi)基因中,mi RNA分子的占比僅僅為1%,卻對(duì)1/3甚至更多的基因表達(dá)、修飾、翻譯以及轉(zhuǎn)錄等發(fā)展過(guò)程發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。mi RNA,或可作為價(jià)值突出的分子標(biāo)志物,為臨床及早診治惡性腫瘤、做好預(yù)后評(píng)估提供全新的方向。mi RNA-200家族,已是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)普遍關(guān)注的焦點(diǎn)。mi RNA-200家族有5個(gè)關(guān)鍵的成員:1)mi RNA-200a;2)mi RNA-200b;3)mi RNA-200c;4)mi RNA-141;5)mi RNA-429。該家族呈現(xiàn)出高保守性、較強(qiáng)的時(shí)序性、基因簇集性以及組織特異性等諸多特點(diǎn)。在肝癌以及腎細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤中,該家族均有表達(dá)水平下調(diào);然而,在膀胱癌、宮頸癌等惡性腫瘤中,則表達(dá)水平上調(diào)。已有研究證實(shí),mi RNA-200家族中的5個(gè)成員間可協(xié)同作用也可單獨(dú)作用,協(xié)同作用時(shí)能對(duì)ZEB1及ZEB2的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)節(jié),單獨(dú)作用時(shí),其5個(gè)成員還能發(fā)揮阻止EMT發(fā)生的作用。然而,在人類(lèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤中,該家族所擔(dān)任的角色卻尚未得到明確的研究結(jié)論。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)來(lái)對(duì)mi RNA-200家族中的熱門(mén)基因mi RNA-141在結(jié)直腸癌以及癌旁正常兩種組織中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)研究其表達(dá)水平和結(jié)直腸癌患者病理參數(shù)之間存在的關(guān)聯(lián)。利用定量Real-time PCR檢測(cè)mi RNA-141在人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29細(xì)胞中的表達(dá)含量,通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法將mi RNA-141mimics或者是陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)入到人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29中,構(gòu)建高表達(dá)mi RNA-141的模型;接著,利用MTT法來(lái)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè),借助流式細(xì)胞儀對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29的周期變化進(jìn)行分析,最后,通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29自身的遷移能力,分析mi RNA-141對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,從而為進(jìn)一步闡明mi RNA-141在結(jié)直腸癌發(fā)生、演變中擔(dān)任的角色提供理論依據(jù)。借助生物信息學(xué)軟件初步預(yù)測(cè)mi RNA-141潛在可能的靶基因,之后進(jìn)行潛在靶基因的篩選。最后在人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29中,利用雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)來(lái)對(duì)靶基因進(jìn)行驗(yàn)證,以期探討該基因作為腫瘤標(biāo)記物及抗腫瘤治療靶點(diǎn)的可行性研究,希望能夠?yàn)榕R床上的難題提供一些實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),為以后深入研究mi RNA-141的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。第一部分 micro RNA-141在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性目的:探討mi RNA-141在結(jié)直腸癌及其癌旁正常組織中不同的表達(dá)水平,探討其表達(dá)水平和結(jié)直腸癌患者病理參數(shù)之間存在的關(guān)聯(lián)。方法:收集結(jié)直腸癌患者58例術(shù)后的切除標(biāo)本,通過(guò)定量Real-time PCR法來(lái)對(duì)結(jié)直腸癌以及癌旁正常兩種組織中mi RNA-141的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)t檢驗(yàn)以及秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,探討mi RNA-141的表達(dá)水平同結(jié)直腸癌患者病理參數(shù)存在的關(guān)聯(lián)。結(jié)果:1結(jié)直腸癌組織以及癌旁正常組織中mi RNA-141的表達(dá)水平。通過(guò)定量Real-time PCR法來(lái)測(cè)定mi RNA-141在58例結(jié)直腸癌組織及與其配對(duì)的癌旁正常組織中的相對(duì)表達(dá)情況。結(jié)果顯示58例結(jié)直腸癌病例癌組織中mi RNA-141的表達(dá)含量相較于癌旁正常組織明顯下調(diào),結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z值-6.314,P0.001),其中,mi RNA-141在84.48%(49/58)的癌組織中的表達(dá)相較于癌旁正常組織明顯下調(diào)。2 mi RNA-141的表達(dá)水平和結(jié)直腸癌患者病理參數(shù)之間的關(guān)系。通過(guò)秩和檢驗(yàn),分析mi RNA-141的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者各項(xiàng)臨床病理參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示:在58例結(jié)直腸癌癌組織中,mi RNA-141的檢測(cè)水平和淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移以及腫瘤浸潤(rùn)深度之間有明顯的相關(guān)性(P0.05),而與患者的性別、年齡、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及脈管瘤栓等因素,則未見(jiàn)明顯的相關(guān)性(P0.05)。第二部分micro RNA-141對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制研究目的:研究mi RNA-141對(duì)人結(jié)直腸癌胞株HT29細(xì)胞的增殖、周期以及遷移能力的影響。方法:運(yùn)用定量Real-time PCR法來(lái)對(duì)3株結(jié)直腸癌細(xì)胞中各自的表達(dá)水平分別進(jìn)行檢測(cè),選定體外細(xì)胞模型,轉(zhuǎn)染mi RNA-141 mimics或者是陰性對(duì)照,構(gòu)建高表達(dá)mi RNA-141的模型;之后,利用MTT法來(lái)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè),借助流式細(xì)胞儀及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞周期及遷移能力,探討結(jié)直腸癌細(xì)胞中mi RNA-141水平對(duì)細(xì)胞各種生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制研究。結(jié)果:1 mi RNA-141在多株人結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平。通過(guò)定量Real-time PCR分別對(duì)3株人結(jié)直腸癌細(xì)胞株(HCT8、HT29和HCT116)的mi RNA-141表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),并取癌旁正常組織檢測(cè)值作為對(duì)照,由此表明:mi RNA-141在HCT8、HT29和HCT116這3株結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平均顯著下調(diào),降低的倍數(shù)依次為9.92倍、7.28倍以及2.95倍(P0.05)。2人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29轉(zhuǎn)染后mi RNA-141的表達(dá)水平。應(yīng)用定量Real-time PCR法對(duì)成功轉(zhuǎn)染了mi RNA-141 mimics以及陰性對(duì)照組的細(xì)胞中mi RNA-141的不同表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染mi RNA-141mimics 48h后結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞中mi RNA-141的表達(dá)水平相較于空白、陰性?xún)蓚�(gè)對(duì)照組均有明顯的上調(diào),平均上調(diào)倍數(shù)為10.5倍(P0.05)。這就說(shuō)明:mi RNA-141 mimics已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)染。3 mi RNA-141過(guò)表達(dá)對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29細(xì)胞增殖產(chǎn)生的影響。轉(zhuǎn)染mi RNA-141以及陰性對(duì)照24h、48h以及72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn),通過(guò)MTT方法對(duì)HT29細(xì)胞實(shí)際的增殖狀態(tài)分別作出檢測(cè),結(jié)果:轉(zhuǎn)染24h、48h以及72h后,mi RNA-141 mimics實(shí)驗(yàn)組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值依次為0.307±0.010、0.361±0.015以及0.461±0.028;陰性對(duì)照組相應(yīng)的OD值則分別為0.338±0.006、0.503±0.008以及0.774±0.011,不同時(shí)間點(diǎn)上,兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。利用OD值可以對(duì)細(xì)胞抑制率進(jìn)行計(jì)算,mi RNA-141 mimics實(shí)驗(yàn)組在轉(zhuǎn)染24h時(shí)的抑制率為10.70±1.87%,轉(zhuǎn)染48h時(shí)的抑制率為30.34±1.25%,而在轉(zhuǎn)染72h時(shí)的抑制率則為40.89±3.16%;陰性對(duì)照組,在不同時(shí)間點(diǎn)上的抑制率依次為1.59±1.18%、2.92±1.55%和0.86±0.37%,兩組相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)�？梢�(jiàn):結(jié)直腸癌細(xì)胞中的mi RNA-141水平升高,能對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖起到較好的抑制作用。4 mi RNA-141過(guò)表達(dá)對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29細(xì)胞周期產(chǎn)生的影響。借助流式細(xì)胞儀來(lái)對(duì)mi RNA-141轉(zhuǎn)染48h之后的HT29細(xì)胞周期作出檢測(cè),由此得知:轉(zhuǎn)染48h后,mi RNA-141 mimics實(shí)驗(yàn)組在G1期、S期以及G2期這三個(gè)不同分期上的占比依次為73.77±0.84%、8.97±0.44%和18.46±1.39%,而陰性對(duì)照組三期的比例分別為42.11±0.81%、43.56±1.26%以及14.73±2.05%,其中,G1期、S期上兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),G1期伴有明顯的阻滯現(xiàn)象。這就提示:結(jié)直腸癌細(xì)胞中的mi RNA-141水平升高,或可對(duì)細(xì)胞由G1期發(fā)展為S期起到較好的阻滯和延緩作用。5 mi RNA-141過(guò)表達(dá)對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29細(xì)胞遷移能力產(chǎn)生的影響。利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行檢驗(yàn)和分析,由此得知:轉(zhuǎn)染24h后,mi RNA-141 mimics實(shí)驗(yàn)組在顯微鏡下觀察到的遷移寬度為345.40±17.34μm,陰性對(duì)照組則為270.61±18.31μm,相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。提示:mi RNA-141過(guò)表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞,其遷移能力相較于陰性對(duì)照組明顯更低。第三部分micro RNA-141靶基因的驗(yàn)證及其機(jī)制研究目的:篩選和檢驗(yàn)MAP4K4 m RNA可否作為mi RNA-141的靶基因,為探討mi RNA-141有效的分子機(jī)制提供可靠的依據(jù)。方法:借助生物信息學(xué)軟件來(lái)預(yù)測(cè)分析mi RNA-141的靶序列并進(jìn)一步初篩靶基因;確定靶基因研究對(duì)象后,通過(guò)雙螢光素酶報(bào)告基因法,進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)靶基因是否真實(shí)可靠。結(jié)果:1運(yùn)用Micro RNA生物信息學(xué)網(wǎng)站和軟件預(yù)測(cè)mi RNA-141靶基因。應(yīng)用Target Scan、Pic Tar和mi Randa等諸多類(lèi)型的生物信息學(xué)網(wǎng)站和軟件進(jìn)行初篩;具體結(jié)果:mi RNA-141位于人12號(hào)染色體,具體位置為12:6964097-6964191[+]。應(yīng)用Target Scan、Pic Tar和mi Randa軟件預(yù)測(cè)分析的mi RNA-141可能的靶基因數(shù)依次為1016、465和7721。本實(shí)驗(yàn)選取了近年來(lái)備受關(guān)注的MAP4K4基因(NM_004834)進(jìn)行重點(diǎn)研究,得知3’UTR中可能存在和mi RNA-141之間進(jìn)行結(jié)合的1段位點(diǎn)。結(jié)合該序列建立起報(bào)告載體,之后通過(guò)雙螢光素酶報(bào)告基因法來(lái)對(duì)其作出進(jìn)一步分析和驗(yàn)證。2經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn):MAP4K4可作為mi RNA-141的靶基因。我們利用“雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)”對(duì)MAP4K4究竟可否作為mi RNA-141的靶基因作出了有效驗(yàn)證。研究首先建立了MAP4K4 3’UTR以及突變型MAP4K43’UTR各自的表達(dá)載體;利用人結(jié)直腸細(xì)胞系HT29細(xì)胞作為模型,依次向人結(jié)直腸細(xì)胞系HT29細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染(1)MAP4K4 3’UTR+mi RNA-141mimics;(2)MAP4K4 3’UTR+mi RNA-141 NC;(3)MAP4K4 mut 3’UTR+mi RNA-141 mimics;(4)MAP4K4 mut 3’UTR+mi RNA-141 NC;劃分為4個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)小組;48h后可知:螢光素蛋白的表達(dá)水平有所下調(diào)的僅為MAP4K4 3’UTR+mi RNA-141 mimics組(P0.05),說(shuō)明mi RNA-141對(duì)MAP4K4 3’UTR報(bào)告基因的活性存在靶向抑制。然而,mi RNA-141卻無(wú)法對(duì)MAP4K4 mut 3’UTR表達(dá)載體起到任何的抑制作用;mi RNA-141 NC同樣也無(wú)法對(duì)MAP4K4 3’UTR表達(dá)載體和MAP4K4mut 3’UTR表達(dá)載體起到任何的抑制作用(P0.05)。本研究表明MAP4K4是mi RNA-141的靶基因,提示mi RNA-141對(duì)MAP4K4有顯著的抑制功能。結(jié)論:1 mi RNA-141在結(jié)直腸癌患者癌組織中表達(dá)顯著低于配對(duì)癌旁非癌組織,提示mi RNA-141可能不適合作為結(jié)直腸癌早期診斷的分子標(biāo)志物,然而,上調(diào)mi RNA-141內(nèi)源性表達(dá)水平,可能有助于臨床防治結(jié)直腸癌,有望變成將來(lái)對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行診治的分子靶標(biāo)。2 mi RNA-141在癌組織中的低表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有明顯的相關(guān),推測(cè)其在結(jié)直腸癌的發(fā)生、演變中發(fā)揮重要的作用。3 mi RNA-141在3株人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT8、HT29和HCT116中的表達(dá)水平均有明顯的下調(diào),和結(jié)直腸癌組織檢測(cè)情況相符。4 mi RNA-141在人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29的過(guò)表達(dá)可對(duì)細(xì)胞增殖起到較好的抑制作用。說(shuō)明mi RNA-141或可成為細(xì)胞增殖的重要的調(diào)控分子,從而作為臨床對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行治療的有效靶標(biāo)。5 mi RNA-141在人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29的過(guò)表達(dá)可阻滯腫瘤細(xì)胞由G1期發(fā)展為S期;故此推測(cè):mi RNA-141或可對(duì)細(xì)胞周期存在影響,從而對(duì)細(xì)胞增殖發(fā)揮相應(yīng)的抑制作用。6 mi RNA-141在人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29的過(guò)表達(dá)可削弱細(xì)胞在體外所擁有的遷移能力。故此推測(cè):mi RNA-141或可對(duì)細(xì)胞遷移存在影響,從而影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。7利用“雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)”驗(yàn)證了MAP4K4確可作為mi RNA-141有效的靶基因,說(shuō)明mi RNA-141對(duì)MAP4K4存在抑制性功能的作用;mi RNA-141可能通過(guò)對(duì)MAP4K4的生物學(xué)功能加以抑制,從而對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生、演變以及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等起到調(diào)節(jié)的作用,為臨床繼續(xù)探討和明確mi RNA-141在結(jié)直腸癌中的分子機(jī)制提供有力的參考。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

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1 鄭志范;蘇華芳;鄒燕;彭振;吳式t;;microRNA在食管癌放射抵抗細(xì)胞表達(dá)譜研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2011年09期

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本文編號(hào)：1484954