本文關(guān)鍵詞： E3泛素連接酶DTL 乳腺癌 細胞周期 細胞增殖　出處：《浙江大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：乳腺癌是世界范圍內(nèi)嚴重威脅女性健康,最常見并且致死率很高的腫瘤。盡管乳腺癌的治療療效不斷提高,但仍有相當(dāng)一部分患者復(fù)發(fā)或?qū)ΤＲ?guī)治療耐藥。進一步篩選和發(fā)現(xiàn)乳腺癌治療的新靶標(biāo),可能為乳腺癌的診治提供新的思路。我們對乳腺癌細胞系基因表達譜芯片結(jié)果進行分析后,篩選出與乳腺癌生長相關(guān)的一個E3泛素連接酶DTL (denticleless E3 ubiquitin protein ligase),并對其在乳腺癌細胞中的表達和功能進行了初步研究。為了探究DTL在乳腺癌細胞中可能發(fā)揮的調(diào)控作用,我們首先通過熒光定量PCR (Q-PCR)和Western Blot的方法確定了DTL在幾種乳腺癌細胞系中的表達情況,發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌細胞中的表達較正常細胞高。用免疫熒光與激光共聚焦顯微鏡觀察了DTL細胞亞定位情況,DTL定位于細胞質(zhì)和細胞核。然后我們利用RNA干擾技術(shù)在MCF-7, MDA-MB-231中下調(diào)DTL的表達,通過MTT比色法和Brdu標(biāo)記法檢測細胞增殖情況,發(fā)現(xiàn)干擾DTL可以明顯抑制乳腺癌細胞MCF-7,MDA-MB-231的增殖。因此我們推測DTL可能是通過影響細胞周期來發(fā)揮其調(diào)控作用的。接著我們在MCF-7, MDA-MB-231這兩種細胞中轉(zhuǎn)染siRNA-DTL后利用流式細胞術(shù)觀察細胞周期的變化,發(fā)現(xiàn)干擾DTL后使得乳腺癌細胞周期G1期比例減少,G2/M期細胞比例增多。接著,我們通過RT-qPCR檢測了幾種常見的細胞周期蛋白、蛋白激酶以及蛋白激酶抑制因子的表達情況,發(fā)現(xiàn)在MCF-7中干擾DTL后可顯著促進細胞周期蛋白激酶抑制因子P21 mRNA的表達, Western Blot提示干擾DTL后P21的蛋白水平也增加。說明DTL對細胞周期的作用可能通過調(diào)節(jié)P21的表達來發(fā)揮作用,但具體如何發(fā)揮作用,是否通過泛素相關(guān)的途徑還是其他機制還有待于進一步研究。但在MDA-MB-231中siRNA-DTL后P21的mRNA和蛋白質(zhì)水平?jīng)]有變化,可能在不同的細胞中DTL的作用機制不同,有待于后續(xù)進一步驗證。綜上,在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)DTL在各種乳腺癌細胞中高表達,干擾DTL可以抑制乳腺癌細胞增殖,使細胞周期阻滯在G2/M期。DTL可能通過抑制P21的表達,促進MCF-7細胞的增殖,有可能作為乳腺癌的潛在治療靶點。
[Abstract]:Breast cancer is a worldwide threat to women's health, the most common and with a high mortality rate, despite the increasing therapeutic efficacy of breast cancer. However, a considerable number of patients still recur or are resistant to conventional therapy. New targets for breast cancer therapy are further screened and identified. It may provide a new idea for the diagnosis and treatment of breast cancer. We analyze the results of gene expression microarray of breast cancer cell line. An E3-ubiquitin ligase DTL denticleless E3 ubiquitin protein associated with breast cancer growth was screened. In order to explore the possible regulatory role of DTL in breast cancer cells, the expression and function of DTL in breast cancer cells were studied. We first determined the expression of DTL in several breast cancer cell lines by fluorescence quantitative PCR Q-PCR and Western Blot. It was found that its expression in breast cancer cells was higher than that in normal cells. The sublocalization of DTL cells was observed by immunofluorescence and confocal laser microscopy. DTL was located in cytoplasm and nucleus. Then we down-regulated the expression of DTL in MCF-7 and MDA-MB-231 by RNA interference technique. The proliferation of breast cancer cells was detected by MTT colorimetry and Brdu labeling. It was found that interfering with DTL could significantly inhibit MCF-7 of breast cancer cells. The proliferation of MDA-MB-231. Therefore, we speculate that DTL may play a regulatory role by affecting cell cycle. We then work in MCF-7. The changes of cell cycle were observed by flow cytometry after transfection of siRNA-DTL into MDA-MB-231 cells. It was found that interfering with DTL reduced the proportion of G _ 2 / M phase cells in breast cancer cell cycle. Then, we detected several common cell cycle proteins by RT-qPCR. The expression of protein kinase and protein kinase inhibitor showed that interfering with DTL in MCF-7 could significantly promote the expression of cyclin kinase inhibitor P21 mRNA. Western Blot suggested that the protein level of P21 increased after interfering with DTL, suggesting that the effect of DTL on cell cycle might be mediated by regulating the expression of P21. But how it works. Whether the mechanism is related to ubiquitin or not remains to be further studied, but the mRNA and protein levels of P21 do not change after siRNA-DTL in MDA-MB-231. It is possible that the mechanism of DTL in different cells is different, which needs to be further verified. In summary, we found that DTL is highly expressed in various breast cancer cells in this study. Interfering with DTL can inhibit the proliferation of breast cancer cells and arrest the cell cycle in G _ 2 / M phase. DTL may promote the proliferation of MCF-7 cells by inhibiting the expression of P21. It may be a potential therapeutic target for breast cancer.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：1471847