本文關(guān)鍵詞： 周圍性肺癌 超聲檢測 CDFI HIF-1α MMP9 血管新生 鎘 VEGF 肺腺癌 內(nèi)皮細(xì)胞 血管生成　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：近半個(gè)世紀(jì)以來,在中國乃至世界范圍內(nèi),肺癌的發(fā)病率及死亡率一直在不斷攀升。肺癌最常見的幾個(gè)組織類型包括非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌,前者又可分為大細(xì)胞癌,鱗狀細(xì)胞癌以及腺癌。近年來,由于低焦油含量型煙草產(chǎn)品的出現(xiàn),肺腺癌的發(fā)病率已經(jīng)超過鱗狀細(xì)胞癌,成為肺癌的主要類型。而女性對肺腺癌的易感性較前也有所增加。早期診斷是有效降低肺腺癌死亡率的重要手段。因肺腺癌早期常無明顯容易發(fā)現(xiàn)的特征性臨床癥狀,故早期確診困難很大。腫瘤早期發(fā)生淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移是影響肺腺癌總體預(yù)后的重要原因之一。大部分肺腺癌患者在得到確診時(shí)已處于疾病的晚期階段,甚至已經(jīng)伴有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。雖然隨著分子生物學(xué)技術(shù)和臨床診治水平的高速度發(fā)展,我們對肺腺癌的分子生物學(xué)機(jī)制的認(rèn)識有了一些進(jìn)步,但我們對于其發(fā)病詳細(xì)機(jī)制仍然認(rèn)識不足,目前缺乏行之有效的可以早期確診肺腺癌以及判斷其預(yù)后的方法。故需要進(jìn)行更多的研究,來闡明相關(guān)的發(fā)病分子機(jī)制,以期找到更合適的早期診斷、治療以及預(yù)防肺腺癌轉(zhuǎn)移的有效方法,來延長患者的生存期限,提高患者生活質(zhì)量。惡性腫瘤的生物學(xué)特性就是無限制的生長。這種不受任何限制的增生一方面會奪取掉大量正常組織生長需要的營養(yǎng)物質(zhì),從而導(dǎo)致機(jī)體感覺體乏無力,出現(xiàn)身體逐漸消瘦甚至出現(xiàn)惡病質(zhì)的現(xiàn)象；另一方面腫瘤細(xì)胞的增生還會產(chǎn)生大量的毒素,可以引起機(jī)體產(chǎn)生各種不適癥狀,例如持續(xù)低熱等。惡性腫瘤可以通過直接轉(zhuǎn)移、血液途徑轉(zhuǎn)移以及淋巴管路途徑等轉(zhuǎn)移到周圍臨近組織器官或者遠(yuǎn)處器官形成新的轉(zhuǎn)移灶,故惡性腫瘤的預(yù)后較差。因?yàn)樾律芸蔀槟[瘤組織提供生長所必須的充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì),腫瘤細(xì)胞的增殖、對周圍臨近組織的浸潤以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均是以血管生成為基礎(chǔ)的。HIF-1α為特異性低氧狀態(tài)下具有活性的轉(zhuǎn)錄因子,其表達(dá)較為廣泛,在多種惡性腫瘤中都參與腫瘤血管的新生活動(dòng)。細(xì)胞外基質(zhì)具有阻止細(xì)胞自由移動(dòng)的的作用,如果被降解則失去阻止細(xì)胞移動(dòng)的功能,從而有利于腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移�；|(zhì)金屬蛋白酶可以降解掉細(xì)胞外基質(zhì)的多種膠原。正常情況下,細(xì)胞外基質(zhì)的膠原可以防止腫瘤細(xì)胞入侵,無論是阻止腫瘤細(xì)胞侵襲還是防止腫瘤細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,細(xì)胞外基質(zhì)均發(fā)揮重要作用。一旦細(xì)胞外基質(zhì)被酶水解,其防御功能減弱,更有利于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。金屬蛋白酶-9是基質(zhì)金屬蛋白酶的一種,在腫瘤生長和侵襲過程中發(fā)揮重要作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道,金屬蛋白酶-9表達(dá)的水平與非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后有相關(guān)性。臨床上大家較認(rèn)可的腫瘤新生血管評價(jià)方法是免疫組化染色后測定腫瘤組織的微血管密度,從而可以評價(jià)腫瘤新生血管的有關(guān)信息。準(zhǔn)確度高,但是因其為有創(chuàng)性操作,患者常不愿接受該檢查。而且因?yàn)橛袆?chuàng),該檢查對于持續(xù)評價(jià)腫瘤血管治療后的情況變化可操作性欠佳。因此,隨著影像學(xué)檢查技術(shù)的迅速發(fā)展,CT、MRI、超聲等在腫瘤血管評價(jià)方面都做了相應(yīng)的嘗試。既往認(rèn)為,因受肺內(nèi)氣體的強(qiáng)反射和肩胛骨及肋骨的干擾,超聲在肺部的應(yīng)用受到很大限制。但近年來,隨著超聲儀器的更新?lián)Q代以及技術(shù)的不斷進(jìn)步,超聲在胸壁、肺周邊部病變,肺水腫等疾病中的應(yīng)用逐漸增多。超聲對于肺癌,主要是鄰近胸壁的周圍型肺癌、肺上溝肺癌,鄰近膈肌的肺底部癌及合并阻塞性肺炎或肺不張的某些深部肺癌的診斷有其獨(dú)特的價(jià)值。超聲多普勒具有無創(chuàng)、可重復(fù)性強(qiáng)、可實(shí)時(shí)監(jiān)測組織血流變化等特點(diǎn),故可以結(jié)合CDFI檢測腫瘤組織血供情況,從而為評價(jià)腫瘤組織血管新生程度提供新的無創(chuàng)檢測方法。本研究第一部分旨在通過檢測肺腫瘤組織中MMP9、HIF-la的表達(dá)情況,結(jié)合超聲顯示腫塊血供情況,討論超聲血流分級情況在評價(jià)周圍性肺腺癌血管生成程度中的應(yīng)用,為周圍型肺腺癌的無創(chuàng)診斷以及對肺癌治療效果的預(yù)判提供理論依據(jù)。綜合目前醫(yī)學(xué)研究的各種學(xué)說,目前學(xué)術(shù)界大多認(rèn)為惡性腫瘤的發(fā)生是多種因素長期相互作用相互影響的結(jié)果�；\統(tǒng)的說,導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生的多種因素包括內(nèi)因和外因。基因遺傳和基因突變等遺傳因素、內(nèi)分泌因素以及免疫因素均屬于機(jī)體內(nèi)在因素,化學(xué)因素、物理因素、生物因素等均屬于外在環(huán)境因素。現(xiàn)在隨著我國經(jīng)濟(jì)建設(shè)的日新月異,大多數(shù)化學(xué)污染物及重金屬等污染物會隨著農(nóng)藥的應(yīng)用、化工廢料的排放、金屬冶煉后廢舊殘?jiān)膬A倒等各種工業(yè)活動(dòng)進(jìn)入我們的生活環(huán)境中,環(huán)境污染已經(jīng)成為引起惡性腫瘤發(fā)生的重要因素。已經(jīng)有多個(gè)報(bào)道,我國某些地市因生活環(huán)境被某些化學(xué)產(chǎn)品或者某種重金屬污染,從而造成該地區(qū)生活群眾惡性腫瘤集中發(fā)生的現(xiàn)象,甚至出現(xiàn)了“癌癥村”。環(huán)境污染作為惡性腫瘤的誘因已不容忽視。有研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤發(fā)生過程中,重金屬污染物起到較重要的作用。一方面,重金屬污染物被吸收入機(jī)體后可以誘導(dǎo)其基因發(fā)生突變,從而有進(jìn)一步發(fā)生惡性腫瘤的可能,另一方面,已經(jīng)發(fā)生基因突變的機(jī)體,對于其所處周圍環(huán)境中的重金屬污染物的刺激更加敏感。當(dāng)兩者同時(shí)存在于同一機(jī)體時(shí),該機(jī)體發(fā)生腫瘤的可能性會大大增加。有統(tǒng)計(jì)資料顯示,約3/4的腫瘤是由于重金屬污染引起的。例如,已明確發(fā)現(xiàn),砷可以引起包括肺癌、皮膚癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生。目前人類生活環(huán)境中鎘污染主要來源于現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)。重金屬鎘目前已被大量應(yīng)用到油漆、電鍍等行業(yè)中。鎘對人體健康的危害非常之嚴(yán)重。重金屬鎘已經(jīng)被美國毒物管理委員會列為嚴(yán)重危害人體健康的毒物之一。早在1993年時(shí),鎘即被國際腫瘤研究機(jī)構(gòu)劃分為致癌物質(zhì)。鎘在機(jī)體內(nèi)的生物半衰期很長,可達(dá)10～30年,所以,鎘在機(jī)體內(nèi)很容易被蓄積。飲食、吸煙以及相關(guān)職業(yè)暴露是人類長期慢性接觸微量鎘污染的主要來源。長期低劑量接觸鎘對人體可能還有很多嚴(yán)重的目前尚未知的危害。雖然鎘暴露與一些器官發(fā)生腫瘤的關(guān)系尚不清楚,但是已經(jīng)證實(shí),鎘在人體內(nèi)可引起肺癌的發(fā)生。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)有許多關(guān)于鎘引起腫瘤的機(jī)制研究,且有些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在嚙齒類動(dòng)物中,鎘與肺腺癌的發(fā)生有劑量依賴關(guān)系。但鎘是如何促進(jìn)肺腺癌發(fā)生及發(fā)展的,其具體機(jī)制尚不明確。血管新生指的是在已存在的血管上生成新的血管的過程。機(jī)體內(nèi)密布的血管網(wǎng)絡(luò)為機(jī)體組織提供可以交換的氧氣和所需的營養(yǎng)物質(zhì),同時(shí)排出代謝產(chǎn)物。對腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移等實(shí)體腫瘤的生長過程同樣有著非常重要的作用。據(jù)報(bào)道,在含氧量偏低的環(huán)境中,腫瘤細(xì)胞可以在其局部分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)等多種促進(jìn)血管生成因子。血管內(nèi)皮細(xì)胞上分布有多種生長因子受體的表達(dá),例如VEGF受體2,FGF受體1等。這些受體與其相應(yīng)生長因子結(jié)合后,一系列調(diào)節(jié)因子被激活而發(fā)揮作用,使得血管內(nèi)皮細(xì)胞增生能力及遷移能力增強(qiáng)。據(jù)研究證實(shí),鎘對血管內(nèi)皮有毒性作用。但迄今為止,鎘對于腫瘤血管生長的作用仍存有爭議。有研究表明,在一定的濃度范圍內(nèi),鎘可以增加VEGFR2活性并促進(jìn)內(nèi)皮組織血管形成。然而,也有研究表明,鎘可以損傷人乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生的能力。故鎘對肺腺癌中血管生成是否有影響目前尚未明確。為闡明鎘在肺腺癌血管新生中的作用及其機(jī)制,我們觀察鎘對人肺腺癌細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(b-FGF)表達(dá)及分泌的影響,觀察鎘處理的A549腫瘤條件培養(yǎng)液與HUVECs共培養(yǎng)時(shí)對HUVECs增殖、遷移及凋亡的影響；觀察鎘直接作用于A549細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡的影響,以期發(fā)現(xiàn)鎘在肺腺癌血管新生、惡性腫瘤生成、侵襲及轉(zhuǎn)移中的作用及作用機(jī)制。第一部分：超聲檢測肺腺癌血流分級與血管生成的相關(guān)性研究研究目的：應(yīng)用多普勒超聲評價(jià)周圍性肺腺癌的血供情況,通過檢測腫瘤組織血管分布密度特點(diǎn),反應(yīng)腫瘤血供程度。同時(shí)檢測肺腺癌組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1a(HIF-1α)、MMP9在腫瘤組織中表達(dá)水平,比較周圍型肺腺癌血管生成因子與其相應(yīng)多普勒超聲評價(jià)血流分級之間的關(guān)系。研究方法：對66例經(jīng)術(shù)后病理診斷為肺腺癌的周圍性肺癌病人術(shù)前進(jìn)行常規(guī)二維超聲和CDFI檢查,根據(jù)CDFI所示血供豐富程度共分為O～Ⅲ4個(gè)等級,其中O-Ⅰ級為乏血供組,Ⅱ～Ⅲ級為富血供組。將患者手術(shù)切除的腫瘤組織,運(yùn)用免疫組化方法檢測HIF-1α、MMP9在肺癌組織中的表達(dá)情況。結(jié)果：66例肺腺癌患者,CDFI示血流分級為0級肺腺癌患者16例,其中6例HIF-1α表達(dá)陽性,陽性率為37.5%,5例MMP9表達(dá)陽性,陽性率為31.2%。CDFI示血流分級為Ⅰ級肺腺癌患者共11例,其中6例HIF-1α表達(dá)陽性,陽性率為54.5%,5例MMP9表達(dá)陽性,陽性率為45.4%。CDFI示血流分級為Ⅱ級肺腺癌患者共23例,其中16例HIF-1α表達(dá)陽性,陽性率為69.5%,15例MMP9表達(dá)陽性,陽性率為65.2%。CDFI示血流分級為Ⅲ級肺腺癌患者共16例,其中12例HIF-1α表達(dá)陽性,陽性率為75%,13例MMP9表達(dá)陽性,陽性率為81.2%。肺腺癌病灶內(nèi)超聲血流分級與HIF-1α及MMP9的表達(dá)呈正相關(guān)(P0.05)。結(jié)論：超聲探及周圍性肺腺癌的血供分級水平能反應(yīng)相應(yīng)病灶內(nèi)血管新生程度,對臨床選擇肺癌的診治方案有一定意義。第二部分：低濃度鎘致肺腺癌血管新生機(jī)制的研究研究目的：通過檢測一系列低濃度鎘對肺腺癌A549細(xì)胞VEGF和b-FGF表達(dá)和分泌的影響,進(jìn)一步收集鎘處理的A549肺腺癌細(xì)胞條件培養(yǎng)液,觀察條件培養(yǎng)液對HUVECs細(xì)胞的影響。探討在體外實(shí)驗(yàn)中,鎘對肺腺癌腫瘤細(xì)胞血管新生的影響及其可能的作用機(jī)制。研究內(nèi)容、方法：1.Cd對人肺腺癌A549細(xì)胞VEGF及b-FGF的影響。使用不同濃度的CdCl2 (0.1μM,0.5μM, 1μM,5μM, and 10μM)處理人肺腺癌A549細(xì)胞,觀察A549細(xì)胞生長情況,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測不同濃度鎘處理后A549細(xì)胞中VEGF及b-FGF mRNA的表達(dá)水平。用免疫印跡法(Western blotting)檢測鎘處理后A549細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的變化,ELISA法檢測鎘處理后A549細(xì)胞VEGF及b-FGF的分泌。分析鎘對肺腺癌A549細(xì)胞VEGF及b-FGF的影響。2.Cd處理的A549細(xì)胞條件培養(yǎng)液對HUVECs細(xì)胞增殖和遷移的影響。制作A549細(xì)胞條件培養(yǎng)液。使用A549細(xì)胞條件培養(yǎng)液處理HUVECs細(xì)胞,采用MTT法檢測Cd處理的A549條件培養(yǎng)液對HUVEC細(xì)胞增殖的影響。用ECIS法檢測HUVECs細(xì)胞損傷后修復(fù)(遷移)情況。使用流式細(xì)胞儀檢測HUVECs細(xì)胞的凋亡率。3.Cd對人肺腺癌A549細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的影響。使用1μM CdCl2處理A549人肺腺癌細(xì)胞株,使用免疫印跡法(Western blotting)檢測A549細(xì)胞HIF-la蛋白的表達(dá)。4.Cd對人肺腺癌A549細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響。使用不同濃度的CdCl2 (0.1μM,0.5μM, 1μM,5μM, and 10μM)處理人肺腺癌細(xì)胞A549,用MTT檢測鎘對A549細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響。結(jié)果：1.低濃度Cd(0.5μM,1μM)可以促進(jìn)人肺腺癌A549細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá),Cd對人肺腺癌A549細(xì)胞b-FGF mRNA的表達(dá)無明顯影響。人肺腺癌A549細(xì)胞經(jīng)0.5μM、1μM Cd處理后,VEGF mRNA水平明顯增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.5μM:1.52±0.17,P0.05:1μM:2.5±0.39,P 0.01).人肺腺癌A549細(xì)胞經(jīng)0.1μM、5μM、10μM Cd處理后,VEGF mRNA水平無明顯變化(0.1μM:1.07±0.04,P=O005:5μM:1.53±0.51,P=0.154; 10μM:1.11±0.23,P=0.468).人肺腺癌A549細(xì)胞經(jīng)不同濃度Cd處理后,b-FGF mRNA水平均無明顯變化。2.低濃度Cd(1μM)促進(jìn)人肺腺癌A549細(xì)胞VEGF蛋白的合成和分泌,對b-FGF蛋白分泌無明顯影響。人肺腺癌A549細(xì)胞經(jīng)1μM Cd處理后,細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白水平明顯增加(Control:1.11±0.13:Cd:1.79±0.17,P0.05),培養(yǎng)基中VEGF水平明顯增加(1.58±0.11,P0.01),b-FGF無明顯變化(1.05±0.14,P=0.74)。3.鎘處理后的肺腺癌A549細(xì)胞條件培養(yǎng)液可促進(jìn)HUVECs細(xì)胞增殖和遷移。與對照組相比,經(jīng)Cd-A549條件培養(yǎng)液后,MTT顯示HUVECs細(xì)胞增殖明顯增加(1.25±0.06,P0.01),ECIS示跨細(xì)胞電阻明顯增加(1.64±0.19,P0.05),也證明HUVECs細(xì)胞的遷移明顯增加。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果示細(xì)胞凋亡無明顯變化。4.低濃度Cd促進(jìn)人肺腺癌A549細(xì)胞HIF-1p的蛋白合成。人肺腺癌A549細(xì)胞經(jīng)1μMM Cd處理后,細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白水平明顯增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.Cd對人肺癌腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞的增殖能力、遷移能力及凋亡均無明顯影響。人肺腺癌A549細(xì)胞經(jīng)一系列濃度Cd(0.1μMM,0.5μM,1μM,5μM,and 10μM)處理后,MTT檢測發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞增殖能力無明顯變化,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞遷移能力無明顯變化,流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示A549細(xì)胞凋亡無明顯變化。結(jié)論：1.低濃度鎘刺激人肺腺癌A549細(xì)胞,使A549細(xì)胞VEGF表達(dá)和分泌增加,從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移,發(fā)揮其促進(jìn)腫瘤血管新生的作用。2.低濃度鎘可能通過增加HIF-1α的合成促進(jìn)VEGF的分泌。3.低濃度鎘對肺腺癌細(xì)胞本身的生長和增殖沒有明顯的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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